KOD SYBR qPCR Mix実施例2
ゲノムDNA相対定量

【データご提供】
 日本大学 薬学部 ゲノム創薬学研究室 小林 秀昭 先生

【結果】
1. 融解曲線 (鋳型DNA 5ng)


KOD SYBR® qPCR Mixでは融解曲線は1つのピークであったが、A社リアルタイムPCR試薬では複数のピークが認められた。

2. 増幅曲線


KOD SYBR® qPCR Mix、A社リアルタイムPCR試薬ともにサンプルの量に応じて増幅が認められた。KOD SYBR® qPCR Mixの方が増幅の立ち上がりが早く、また、飽和に達する近傍まで直線的に増幅が認められた。これに対し、A社リアルタイムPCR試薬では、途中から傾きが緩やかになってきた。

【サンプル】ゲノムDNA

【遺伝子名】A

【プライマー】 Primer1: 24mer, Tm 60℃、Primer2: 24mer, Tm 58℃

【ターゲット長】 533bp

【反応条件】
 <KOD SYBR® qPCR Mix>
 KOD SYBR® qPCR Master Mix    5  μL
 50×ROX reference dye             0.2μL
 Primer1 (10μM)                       0.2μL
 Primer2 (10μM)                       0.2μL
 鋳型DNA                                  1  μL
 DDW                                      3.4μL 
 Total                                     10  μL

 <A社リアルタイムPCR試薬>
 SYBR® Green Master Mix        5  μL
 Primer1 (10μM)                     0.2μL
 Primer2 (10μM)                     0.2μL
 鋳型DNA                                1  μL
 DDW                                    3.6μL  
 Total                                   10  μL

【PCRサイクル】
 <KOD SYBR® qPCR Mix>
 98℃, 2 min.
 ↓
 (98℃, 10 sec. - 60℃, 10 sec. - 68℃, 30 sec) × 40 cycles
 ↓
 melt curve

 <A社リアルタイムPCR試薬>
 95℃, 20 sec.
 ↓
 (95℃, 3 sec. - 60℃, 30 sec.) × 40 cycles
 ↓
 melt curve

【測定機器】 StepOnePlus (ライフテクノロジーズ)

【コメント】
KOD SYBR® qPCR Mixは、PCRに用いていたプライマーをそのまま利用できると思われた。このため利便性や汎用性が高いと感じた。