実施例

KOD SYBR™ qPCR Mix 実施例7 ゲノムDNA相対定量

【データご提供】
 日本大学 薬学部 ゲノム創薬学研究室 小林 秀昭 先生

【結果】
1. 融解曲線 (鋳型DNA 5ng)



KOD SYBR™ qPCR Mixでは融解曲線は1つのピークであったが、A社リアルタイムPCR試薬では複数のピークが認められた。

2. 増幅曲線


KOD SYBR™ qPCR Mix、A社リアルタイムPCR試薬ともにサンプルの量に応じて増幅が認められた。KOD SYBR™ qPCR Mixの方が増幅の立ち上がりが早く、また、飽和に達する近傍まで直線的に増幅が認められた。これに対し、A社リアルタイムPCR試薬では、途中から傾きが緩やかになってきた。

【サンプル】ゲノムDNA

【遺伝子名】A

【プライマー】 Primer1: 24mer, Tm 60℃、Primer2: 24mer, Tm 58℃

【ターゲット長】 533bp

【反応条件】

<KOD SYBR™ qPCR Mix>			<A社リアルタイムPCR試薬>
KOD SYBR™ qPCR Master Mix	5  μL		SYBR™ Green Master Mix	5  μL
50×ROX reference dye	0.2μL		Primer1 (10μM)	0.2μL
Primer1 (10μM)	0.2μL		Primer2 (10μM)	0.2μL
Primer2 (10μM)	0.2μL		鋳型DNA	1  μL
鋳型DNA	1  μL		DDW	3.6μL
DDW	3.4μL
Total	10  μL		Total	10  μL

【PCRサイクル】
 <KOD SYBR™ qPCR Mix>
 98℃, 2 min.
     ↓
 (98℃, 10 sec. - 60℃, 10 sec. - 68℃, 30 sec) × 40 cycles
     ↓
 melt curve

 <A社リアルタイムPCR試薬>
 95℃, 20 sec.
     ↓
 (95℃, 3 sec. - 60℃, 30 sec.) × 40 cycles
     ↓
 melt curve

【測定機器】 StepOnePlus (ライフテクノロジーズ)

【コメント】
KOD SYBR™ qPCR Mixは、PCRに用いていたプライマーをそのまま利用できると思われた。このため利便性や汎用性が高いと感じた。

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