実施例

塩野義製薬株式会社 バイオ創薬研究所 バイオ基盤研究1グループ

黒岩 美帆 様

 

<実験の目的>

NGSを用いた、下水に含まれるSARS-CoV-2亜系統を正確な組成比で検出するための技術開発。その精度確認のため、最大7種類のSARS-CoV-2亜系統由来RNAを混合し、正確な組成比で検出できることを実験的に確認した。

(KOD One^®はcDNAの増幅・イルミナのオーバーハング配列付与のためNested PCRに使用)

 

<実験方法>

【サンプルの種類】

SARS-CoV-2のRNA

 

【鋳型の調製方法】

既知の割合でSARS-CoV-2亜系統のRNAを混合し、混合RNA 1,000コピーをReliance Select cDNA Synthesis Kit(バイオラッド社)にて、下記S008プライマーでcDNA合成したものを鋳型に用いた。

 

【ターゲット遺伝子名と長さ】

1st PCR : SARS-CoV-2スパイクタンパクのRBD領域(329-535aa)

2nd PCR : SARS-CoV-2スパイクタンパクのRBD領域(337-504aa)

 

【プライマー配列】

1st PCR

S012: CAACCAACAGAATCTATTGTTAG

S008:AGTTGAAATTGACACATTTG

 

2nd PCR

S013:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTTCCTAATATTACAAACTTGTGC

S009:GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGACTACYACTCTRTATGGTTGGT

 

【PCR条件】

・1st PCR反応液組成		(μL)
	KOD One® PCR Master Mix	20.6
	40μM S012 Primer	0.3
	40μM S008 Primer	0.3
	cDNA溶液	20
	Total Volume	41.2

・1st PCRサイクル

98℃　3sec

↓

98℃　10sec

55℃　5sec

68℃　2sec　　×10

 

・2nd PCR反応液組成		(μL)
	KOD One® PCR Master Mix	10
	20μM S013 Primer	0.5
	20μM S009 Primer	0.5
	1st PCR溶液	3.4
	滅菌水	5.6
	Total Volume	20.0

・2nd PCRサイクル

98℃　3sec

↓

98℃　10sec

61℃　5sec

68℃　2sec　　×45

 

【NGSまでの処理方法】

PCR増幅産物をAgencourt^® AMPure^® XP beads (ベックマンコールター社)で精製し、10mM Tris-HCl(pH8.5)で溶出した。溶出した増幅産物をNextera^® XT Index Kit v2(イルミナ社)にて処理し、再度、Agencourt^® AMPure^® XP beads で精製を行い、MiSeq^®に供した。

 

<結果・考察>

得られたシーケンスリードから、亜系統の割合を計算した。

A : SARS-CoV-2亜系統の混合比率理論値
B : NGS結果から算出されたSARS-CoV-2亜系統の割合

KOD One^®を使用したアンプリコンシーケンスの結果、理論値に近い亜系統の割合が算出されました。KOD One^®は増幅バイアスが少なく、変異率も低いため、シーケンスターゲットの増幅にも最適であると考えます。

<東洋紡からのコメント>
今回紹介した研究は、下水疫学の調査に応用されています。
より詳細を確認なさりたい方は以下をご参照ください。
Targeted amplicon sequencing of wastewater samples for detecting SARS-CoV-2 variants with high sensitivity and resolution - PMC (nih.gov)　
DOI: 10.1016/j.scitotenv.2023.164766

PCRによるシーケンスサンプルの調製は、バイアスを発生させる原因になりますので、増幅バイアスの少ない試薬を選択することが重要です。KOD One^®は増幅バイアスが少なく、16S rRNAアンプリコンシーケンス(菌叢解析)などにも応用可能です。
高速かつ正確な増幅ができることから、ショートリードだけでなくロングリードのアンプリコン作製にも好評いただいております。

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