Can Get Signal immunostain 実施例5 肝癌培養細胞のFOXO1染色における従来法との比較検討(免疫染色)
【データご提供】香川大学医学部細胞情報生理学講座
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【実験方法】
(1)サンプルの由来:培養細胞・HuH-7
※抗原タンパク質の発現誘導の有無 :なし
(2)サンプル調製法:Tissue Cultured Cells
(3)サンプル調製方法、細胞のスライドグラスへの付着方法
Nalgen nunc Labtek II 培養スライド上で培養。4%pafaformaldehydeで15分固定。
(4)ブロッキング、内因性ペルオキシダーゼ活性阻止について、
1. ブロッキング溶液名:10% FCS in PBS
2. インキュベート温度:室温
3. インキュベート時間:1時間
4. 内因性ペルオキシダーゼ活性阻止の方法:0.3% H2O2 in PBS 30 min
(5)抗体について
<1次抗体について>
1. メーカー名:Santa Cruz Biotechnology, Inc.
2. 商品名:FKHR(H-128) antibody
3. 希釈倍率:1/1000
4. 希釈溶媒:10%FCS in PBS or Solution A or Solution B
5. インキュベート温度:4℃
6. インキュベート時間:O/N
<1次抗体の検出方法について>
検出用キット(2次抗体を含む)を使用
<2次抗体,検出用キットについて>
1. メーカー名:Vectastain
2. 商品名:ABC elite kit
3. 希釈倍率:1/200(キットプロトコールに従う)
4. 希釈溶媒:1.5% normal serum/PBS or Solution A or Solution B
5. インキュベート温度:室温
6. インキュベート時間:1時間
(6)発色方法・検出方法について
Avidin-Biotin Complex (ABC) 、DABにて発色
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【結果・コメント】
同条件で、1次抗体、2次抗体のインキュベーションバッファーを比較したところ、
10% FCSに比べ、Solution A, Solution Bともよく染まった。
プロトコールを大幅に変更することなく、バッファーを交換するだけで、染色性が向上した。
今後は他の抗体でも試みたい。良い製品だと思います。
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