実施例

KOD One 実施例16 ニワトリ遺伝子のクローニング用サンプル調製

データご提供 :  岡山大学 大学院医歯薬学総合研究科 細胞組織学分野  佐藤 恵太 様

<実験の目的>
ニワトリの cDNA配列を単離する。

<実験方法>
【サンプルの種類】
ニワトリE17胚 眼組織から調製した1st strand cDNA

【サンプルの調製方法】
ニワトリE17胚 眼組織からニッポンジーン ISOGEN IIによりtotal RNAを抽出
Thermo Fisher Scientific SuperScript III First-Strand Synthesis SystemでオリゴdTプライマーを用い1st strand cDNAを合成

【ターゲット遺伝子長、プライマーTm値】

	ニワトリ遺伝子A	ニワトリ遺伝子B
ターゲット長	約1,500 bp	約2,000 bp
Forward Primer長, Tm	長さ: 20  Tm: 76.2 ℃	長さ: 27  Tm: 68.0 ℃
Reverse Primer長, Tm	長さ :27  Tm: 68.1 ℃	長さ :23  Tm: 69.4 ℃

■KOD One^® PCR Master Mix
【反応液組成】                                                       【PCRサイクル】 

		(μL)
	KOD One® PCR Master Mix	2.5		98℃  1min.
	2μM Primer F	1		98℃  10sec.		35cycles
	2μM Primer R	1		60℃   5sec.
	Template  (濃度未定量)	0.5		68℃  15sec.
	Total Volume	5.0

■A社高速・高正確PCR Master Mix
【反応液組成】                                                       【PCRサイクル】 

		(μL)
	A社高速・高正確 PCR Master Mix	2.5		98℃  1min.
	2μM Primer F	1		98℃  10sec.		35cycles
	2μM Primer R	1		60℃   5sec.
	Template  (濃度未定量)	0.5		72℃  15sec.
	Total Volume	5.0

【サイクラー, 検出機種】
Analytikjena TGradient   ATTO AE-6932GXESプリントグラフ

<結果・考察>
1% Agarose/TAEで泳動、左から1kb ladder (SMOBIO DM3100)、遺伝子A(KOD One)、遺伝子A(A社高速・高正確PCR Master Mix)、遺伝子B(KOD One)、遺伝子B(A社高速・高正確PCR Master Mix)の順。

各サンプルはSMOBIO FluoroDyeと混合してから泳動し、青色LEDで励起して撮影。

遺伝子Aについては非特異的と思われるバンドも多数現れているが、いずれも目的の長さに強いバンドが認められた。KOD One、A社高速・高正確PCR Master Mixいずれにおいても目的のバンドが同等の強さで現れており、増幅効率、特異性などにおいて同等の性能を持っていると考えられる。


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