実施例

KOD -Plus- 実施例5 さまざまな鋳型を用いたLong PCR

【方法】
以下のようにPCR mixを作製し、PCRを実施しました。

PCR mix                                               　　　　　      PCR cycles

D.W.	33.5(μL)		94℃,   2min
10×KOD -Plus- buffer	5		94℃,  15sec.
2mM dNTPs	5		60℃,  30sec.		30～35cycles
25mM MgSO4	2		68℃, A**min
Primer (10μM each)	1.5
Template DNA *	2
KOD -Plus- (1U/μL)	1
	50μl

* Template DNAは、Total量としてλDNA 50ng、Plasmid DNA 1ng、Genomic DNA 200ng、cDNA 2μL (20μL RT反応液中)となるように使用しました。
** Extenshion時間は 1min./kbで計算して設定しました。

【結果および考察】
TemplateがλDNA:21kb、Plasmid DNA:8kb、Genomic DNA:12.3kb、cDNA:6.8kbの長さまで、再現よく増幅することができました。


Long PCRは、Template DNAの状態に左右されます。できるだけ高濃度な状態で保存し、使用直前に必要な量だけ滅菌水などで希釈して使用することをお勧めします。また、Plasmid DNAをTemplateとする場合には、MgSO₄濃度を1.5mMに上げることで増加量の増加がみられます。
また今回よりも短いTargetの場合でもコピー数、配列あるいはプライマーの特異性などによって増幅できないこともあります。そのような場合には、最終濃度2～5%DMSOを反応系に添加することやMgSO₄濃度により改善することがございますので、お試しください。

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