T4ファージ由来リン酸化酵素
T4 Polynucleotide Kinase
TOYOBO
価格表
用途
●DNAリンカー、DNAフラグメントの5'末端のリン酸化
●DNAの5'末端の標識
説明
T4 Polynucleotide Kinaseは、rATPのγ位のリン酸基をDNA及びRNAの5‘末端の水酸基に転移する反応を触媒します。この反応は可逆的であり、rATPまたはrADPの存在下において、5'末端のリン酸の交換反応も行うことができます。
リン酸化反応は、基質のDNAの末端形状に影響されやすいため、それぞれに適した条件にて、反応を行う必要があります。
原理
参考文献
1)C. C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 54: 158(1965)
2)A. M. Maxam and W. Gilbert, Methods in Enzymology, 65: 499(1980)
- 製品内容
T4 Polynucleotide Kinase(5-20U/μL)
10×Protruding End Kinase Buffer [PNK-1P]
10×Blunt End Kinase Buffer [PNK-1B]
Denaturation Buffer [PNK-1D]
形状:
50mM Tris-HCl (pH7.5)
0.1mM EDTA
1mM DTT
50mM KCI
0.1μM ATP
50% Glycerol
10×Protruding End Kinase Buffer [Code No. PNK-1P]組成:
500mM Tris-HCl (pH8.0)
100mM MgCl2
50mM DTT
10×Blunt End Kinase Buffer [Code No. PNK-1B]組成:
500mM Tris-HCl (pH9.5)
100mM MgCl2
50mM DTT
Denaturation Buffer [Code No. PNK-1D]組成:
20mM Tris-HCl (pH9.5)
1mM Spermidine
0.1mM EDTA
活性の定義:
Micrococcal Nucleaseで活性化した仔牛胸腺DNAを基質として、37℃、pH7.6において、30分に1nmoleの[γ-32P]rATPを酸不溶性沈殿物に取り込む酵素量を1Uとします。
起源:
E.coli 組換体
純度:
本酵素10Uと1μgのλDNA/HindⅢ分解物とを、37℃で20時間反応させてもDNAの電気泳動パターンは変化しません。
活性測定条件において、本酵素と1μgの[3H]-E.coli DNAとの反応で、酸可溶性画分に遊離される放射活性は、0.01%/時間/U以下です。
- 基本反応条件
-
<1本鎖及び5'突出2本鎖DNAの標識>
滅菌蒸留水 XμL
基質DNA 5-20pmoles
10×Protruding End
Kinase Buffer 10μL
[γ-32P]rATP(10mCi/mL) 10μL
T4 Polynucleotide Kinase 20U
Total Volume 100μL
↓
37℃, 60min.
<平滑末端及び3'突出2本鎖DNAの標識>
滅菌蒸留水 XμL
基質DNA 5-20pmoles
Denaturation Buffer 75μL
Total Volume 75μL
↓
90℃, 2min.
氷上にて急冷
↓
add:
10×Blunt End
Kinase Buffer 10μL
[γ-32P]rATP(10mCi/mL) 10μL
T4 Polynucleotide Kinase 20U
Total Volume 100μL
↓
37℃, 60min.
90℃, 2min.
室温までゆっくり下げます
<オリゴヌクレオチドの標識>
滅菌蒸留水 XμL
基質DNA 10pmoles
10×Protruding End
Kinase Buffer 1μL
[γ-32P]rATP(3000Ci/mmole) 3-6μL
T4 Polynucleotide Kinase 10U
Total Volume 10μL
↓
37℃, 30min.
95℃, 3min.
rATPは、オリゴヌクレオチドの等モル以上が必要となります。
各比活性の10pmoles相当は以下の通りです。
3000Ci/mmole,10μCi/μL 3μL
6000Ci/mmole,10μCi/μL 6μL
オリゴヌクレオチドの10pmolesの大体の量は以下の通りです。
15mer 50ng
17mer 56ng
20mer 66ng
24mer 80ng
27mer 90ng
30mer 100ng
正確な計算式は総合カタログ12-8ページに記載しています。
この条件にて、約106cpm/pmole以上の標識したオリゴヌクレオチドを得ることができます。.
<5'突出2本鎖DNAのリン酸化>
滅菌蒸留水 XμL
精製DNA断片～1μg
10×Protruding End
Kinase Buffer 5μL
10mM rATP 5μL
T4 Polynucleotide Kinase 5μL (5～20U/μL)
Total Volume 50μL
↓
37℃, 60min.
必要に応じて精製
<平滑末端及び3'突出2本鎖DNAのリン酸化>
滅菌蒸留水XμL
精製DNA断片～1μg
10×Blunt End
Kinase Buffer 5μL
10mM rATP 5μL
T4 Polynucleotide Kinase 5μL (5～20U/μL)
Total Volume 50μL
↓
37℃, 60min.
必要に応じて精製
<オリゴヌクレオチドのリン酸化>
オリゴヌクレオチド(50μM) 14μL
10×Protruding End
Kinase Buffer 2μL
10mM rATP 2μL
T4 Polynucleotide Kinase 2μL (5～20U/μL)
Total Volume 20μL
↓
37℃, 60min.
95℃, 5min.
↓
add:
50μl DW
↓
10μM オリゴヌクレオチド溶液として使用
- ワンポイントアドバイス
●酵素の攪拌について
本酵素は、希釈による活性低下は少ないですが、攪拌に弱い傾向があります。
よって、ボルテックス等による強い攪拌は避けてください。
●PCR産物のリン酸化
PCR産物は様々な夾雑物を含むことが多いため、本酵素によってリン酸化反応を行う場合、効率を上げるためにはあらかじめキット等によって精製を行うことをお薦めします。キットとしては、 MagExtractorTM -PCR & Gel Clean up- などをお勧めします。
English Page
- ※ 法規制について
- 毒： 毒物及び劇物取締法[医薬用外毒物]
- 国： 国民保護法[毒素]
- 劇： 毒物及び劇物取締法[医薬用外劇物]
- 組： カルタヘナ法(遺伝子組換え生物等の使用等の規制による
- 危： 消防法[危険物]
- 生物の多様性の確保に関する法律）
- Ｐ： PRTR法（化学物質排出把握管理促進法）[届け出義務物質]
- 申： ご購入時に申込書の提出が必要な製品
- 労： 労働安全衛生法[通知または表示義務物質]
- なし： 上記法令や申込書の提出に該当しない製品
