高効率ライゲージョン試薬(液状品)
Ligation high Ver.2
TOYOBO
価格表
用途
●ライゲージョン
説明
T4 DNA ligaseを主体とした高効率な1液タイプのライゲーション試薬です。さまざまな末端を持つDNA断片の連結反応に広く用いることができます。従来品に改良を加え、さらにさまざまな用途で簡便にお使いいただけるようになりました。
本品は、おなじみのLigation highを更に使いやすく改良した高効率な1液タイプのライゲーション試薬です。DNA断片と混合し、短時間反応させるだけで、高効率な連結反応を行うことができます。突出末端、平滑末端、及びTAクローニングに幅広く用いることができます。
特長
実施例
1. DNA末端の形状とライゲーション効率との関係
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16℃反応における、DNA断片(0.5kb)のクローニング効率を末端形状別に比較しました。その結果、突出末端ライゲーションでは約5分でほぼライゲーション反応が完了していることが分かりました。また、平滑末端、及びTAクローニングにおいても30分で約70～80%の反応が完了することが分かりました。また、平滑末端クローニング、及びTAクローニングにおいては、1時間を越えて2時間まで徐々に効率が増加することも分かっており、クローニング効率が低い場合は、反応時間を2時間まで延長することにより、さらに効率を向上させることが可能です。
2.未精製PCR産物を用いるTAクローニング
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T ベクター(50 ng, 25 fmol)と、良好な増幅を示した未精製PCR産物(Taq DNA polymeraseで増幅した0.5kb断片)をさまざまな比率で混合したDNA溶液 7.5μL に、Ligation high Ver.2 7.5μLを添加し、16℃で30分間反応しました。その後、反応液10μLを用いてE. coli DH5αコンピテントセル 100μL を形質転換し、LB/Amp(XGal)プレートで培養後、コロニー数をカウントしました。その結果、なるべくPCR反応液の持ち込み量を少なくした方が良好な結果が得られることが分かりました。
また、精製したDNA断片を用いた方が高い効率が得られることが分かっており、効率が低い場合は、精製PCR産物を用いる方が良好な結果が期待できます。
参考文献
1)R. L. Hawkins et al., Current Microbiol., 38: 335-341(1999)
- 製品内容
Ligation high Ver.2 750μL
※1回の使用量を7.5μLとした場合、100回用として使用できます。
- 注意事項
●-30℃以下の温度で長期間保存した場合や、冷凍庫内の冷気の噴出口近くなどに保存した場合、凍結する可能性がありますが、凍結融解実験により5回までは活性が低下しないことを確認しています。凍結した場合は、チューブを指の腹でつまんで、液温が高くならないように注意しながら融解します。
●白濁がみられた場合にも同様に溶解することにより通常通りご使用になれます。
- 基本反応条件
ベクターDNA+インサートDNA 7.5μL
Ligation high Ver.2 3.75～7.5μL*
↓
16℃、30min.
↓
100μLのコンピテントセルに、～10μL
の反応溶液を加え形質転換を行います。
*TAクローニングの場合は7.5μLで行います。
※エレクトロポレーション法を用いる場合は、反応液を脱塩するか、エタノール沈殿によってDNA精製をしてから用いてください。
- ワンポイントアドバイス
●反応時間について
基本的に16℃、30分間を推奨しますが、一般的な突出末端のライゲーションは5分程度で完了します。また、平滑末端やTAクローニングで効率が低い場合は、2時間を目安に反応時間を延長することで更に効率を向上させることができます。実施例1に反応時間に関するデータを掲載しています。
●反応液の持込について
塩の持込はライゲーション反応に影響を及ぼします。TAクローニングに関しても、未精製PCR産物の持ち込みは0.5～1μL(15μL反応)とした方が高い効率を得ることができます。また、MagExtractorTM -PCR & Gel Clean up- などを用いて精製を行うことにより、更に高い効率でTAクローニングを行うことが可能です。
●TAクローニングの効率について
更に、効率を向上させたい場合は、リン酸化したプライマーを用いてPCRを行うことにより効率を向上させることができます。
English Page
- ※ 法規制について
- 毒： 毒物及び劇物取締法[医薬用外毒物]
- 国： 国民保護法[毒素]
- 劇： 毒物及び劇物取締法[医薬用外劇物]
- 組： カルタヘナ法(遺伝子組換え生物等の使用等の規制による
- 危： 消防法[危険物]
- 生物の多様性の確保に関する法律）
- Ｐ： PRTR法（化学物質排出把握管理促進法）[届け出義務物質]
- 申： ご購入時に申込書の提出が必要な製品
- 労： 労働安全衛生法[通知または表示義務物質]
- なし： 上記法令や申込書の提出に該当しない製品
