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qPCRのご質問【KOD SYBR qPCR Mix】

KOD SYBR qPCR Mixと従来品(Taq使用)にはどのような違いがありますか?開 く閉じる

KOD SYBR® qPCR MixはKOD DNA Polymeraseの酵素特性(高効率、クルード成分の阻害を受け

にくい)を活かし、SYBR® Green I アッセイの利便性と汎用性を高めた製品です。以下のような特性の

違いがございます。

【従来品との特性比較】

 

従来品(Taq使用)

KOD SYBR® qPCR Mix

酵素

Taq DNA Polymerase

KOD DNA Polymerase

[exo(-) mutant]

増幅長

70 ~ 300 bp

70 ~ 2000 bp

GCリッチなターゲット

増幅しにくい

増幅しやすい

阻害物質の影響

受けやすい

(DNAの精製が必要)

受けにくい(クルードサンプルから直接増幅可能)

 

こちらに各製品の特長の一覧表がございますので、併せてご覧ください。

どのくらいのGC含量のサンプルが使用できますか?開 く閉じる

GC含量83% のIGF2R遺伝子(cDNA)を検出した事例があります。

 

融解曲線による増幅長多型解析は可能ですか?開 く閉じる

2Kb以下の増幅長で、増幅産物間のTm値の差が3℃以上(機器によっては5℃以上)あれば、ワンチューブ

反応でマルチプレックスPCRや増幅長多型解析などを行うことができます。

 

PCR反応液に生体組織などのクルードサンプルをどのくらいまで添加できますか?開 く閉じる

エンドポイント検出において以下のサンプル量(20μl反応の場合)が添加可能です。

全血     1/10に希釈し、2μl添加
爪       米粒1/3程度を直接添加
髪       毛根から1~2cmを直接添加
口腔粘膜  綿棒などで採取後、200μlの水で懸濁、反応液に5μl添加
培養細胞  ~103 cells
動物組織  アルカリ熱抽出液の上清を0.5~2μl添加
植物組織  ワンステップ法による植物ライセートの10倍希釈液の上清を0.5~2μl添加

一般的なPCR用のプライマーは使用できますか?開 く閉じる

KOD シリーズ等を用いる一般的なPCRにおいて設計した、増幅長が2kbまでの特異性の高いプライマーは、

基本的にはそのまま使用可能です。

 

精製が脱塩のみのプライマーは使用できますか?開 く閉じる

プライマーの精製純度は反応特異性に大きな影響を与えます。可能であればHPLC精製、少なくともカートリッジ(OPC)精製のグレードのプライマーをご使用ください。

 

プライマーや増幅産物のTm値の計算はどのように行えば良いですか?開 く閉じる

最近接塩基対法(Nearest Neighbor method)を用いております。プライマーのTm値計算表(EXCEL)は、

こちらからダウンロードいただけます。
 

どのような機器に使用できますか。開 く閉じる

ブロックタイプの機器(Fast Modeにも対応)のほか、ガラスキャピラリーを用いる高速サイクラーにも対応

しています。また、50×ROX reference dyeが別添付されているため、パッシブリファレンスを必要とする

機器においても各機器に適したROX濃度でご使用頂けます。

 機器

 ROX最終濃度(添加量)

 Applied Biosystems 7000、7300、7700、7900HT、StepOne™、 StepOnePlus™

 1×(1/50量)

 Applied Biosystems 7500、7500Fast、 Agilent Technologies Mx3000P、Mx3005P、Mx4000

 0.1×(1/500量)

 Roche社製機器(LightCycler® 2.0、LightCycler® Nanoなど)、Bio-Rad社製機器(MiniOpticon™、CFX96 Touch™、iCycler IQ®など)、BioFlux Line Geneなど

 不要