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遺伝子組換え/クローニングのご質問【KOD -Plus- Mutagenesis Kit】

何を準備すればよいですか。開 く閉じる

鋳型となるプラスミド、プライマーセット、形質転換用のコンピテントセルをご用意ください。プラスミドは、

dam methylaseを保有する菌株(JM109, DH5αなど)で調製したものをご使用ください。dam methylase

欠失株(JM110, SCS110など)で調製したプラスミドは、JM109, DH5αなどで再調製し直すか、あるいは、

in vitroでdam methylase処理を行ってください。合成プライマーは、HPLCグレード(40merを超える場合は

PAGE精製グレード)をおすすめします。本キットでは、ライゲーションと同時にカイネーションを行うため、

プライマーをあらかじめリン酸化しておく必要はありません。

 

どのような変異導入に対応していますか。開 く閉じる

数bpの置換、挿入、欠失のほか、数10bpの挿入(Tag挿入)や数100bpの欠失に対応します。

 

変異導入効率はどれくらいですか?開 く閉じる

1塩基置換、3塩基欠失、6塩基挿入の変異導入で、平均84%の変異導入効率を得ています。変異導入が

不成功になるのは、プライマー領域の塩基欠損によるものがほとんどです。

 

変異を導入できた最も大きなプラスミドのサイズはどれくらいですか?開 く閉じる

最大11.3kbのプラスミドで確認していますが、KOD -Plus-の増幅可能鎖長(λDNAで21kb)から推察すると、

さらに大きなプラスミドでも可能かと思われます。

 

PCRによって変異が入りませんか?開 く閉じる

正確性の高いKOD -Plus- を用いているため、変異が入る確率は非常に低いです。また、PCRサイクル数

を少なくするプロトコルにしているため、さらに変異が入る確率を低減しています。弊社にてキットのコント

ロール系で作製した変異体24クローンについて、2kbの領域をシーケンシングした結果、目的外の変異は

総48,000塩基中1塩基のみでした。