よくある質問

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遺伝子組換え/クローニングのご質問【Blunting high】

ベクターは入っていますか?開 く閉じる

入っておりません。

 

どのくらいのDNA末端が処理できるのでしょうか?開 く閉じる

キットプロトコール推奨の10μlの反応系で、DNA末端10pmol(約2.7Kbの直鎖状pUC18 DNAの
場合、約10μg)まで処理できます。

 

平滑化反応の時間はどのくらいが良いですか?開 く閉じる

2分間でプラトーに達し、30分間保持しても効率は変わりません。

 

制限酵素処理したDNA溶液をそのまま平滑化反応に使用できますか?開 く閉じる

H、M、L、TAバッファーを用いた反応液であればご使用できます。

 

Taq DNA PolymeraseでのPCR反応溶液をそのまま平滑化反応に使用できますか?開 く閉じる

PCR反応液を一部取り、Taq DNA Polymeraseと同じUnit数のKOD DNA Plolymeraseを加え、

72℃・2min. 処理します。10×Blunting Bufferの添加は不要です。

 

10×Blunting Bufferの組成は、KOD DNAPolymerase(Code No.KOD-101他)添付の10×Buffer#1または10×Buffer#2と同じでしょうか?開 く閉じる

組成は異なります。

 

10×Blunting BufferにdNTPsは入っていますか?開 く閉じる

2 mM (最終濃度0.2mM)で入っております。

 

 

各試薬を加える順番は考慮すべきでしょうか?開 く閉じる

先にKOD DNA Polymeraseを加えた場合、3'→5'exonucleaseが強く作用するため、KOD DNA

Polymeraseは最後に加えてください。

 

ライゲーション反応を行なう前に平滑化反応で加えたKOD DNA Polymeraseを失活させた方が良いですか?開 く閉じる

ライゲーション反応の16℃では、KOD DNA Polymeraseはほとんど作用しませんので、失活させる必要は

ありません。

 

キット添付のLigation highでのライゲーション反応条件は、どのくらいが良いですか?開 く閉じる

Ligation highの標準的なライゲーション条件は16℃・30min.ですが、平滑末端のライゲーションである

ことと、平滑化反応溶液の持ちこみがあることより、16℃・1hr.の条件をお勧めいたします。

 

ライゲーション反応後、サンプルはそのままエレクトロポレーションに使用できますか?開 く閉じる

エタノール沈殿や精製用キットでの脱塩操作が必要になります。