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qPCRのご質問【Realtime PCR Master Mixシリーズ】

プライマーの設計はどのようにすれば良いですか?開 く閉じる

一般的には、長さは20〜30mer、GC含量は40〜60%に設定するのが良いとされています。増幅領域の長さは、200bp以下、できれば150bp以下に設定します。長すぎると増幅効率が低下し、また、非特異反応も起こりや

すくなるため、検出感度が低下します。

 

どのような機器で使用できますか?開 く閉じる

汎用チューブを使用するタイプ(BioFlux社LineGene)や、ガラスキャピラリーを使用するタイプ(Roche社LightCycler)、プレートを使用するタイプ(Appliled Biosystems社ABI PRISM)など、幅広い機器でご使用

いただけます。


 

   機器名
弊社で確認を行った機器 ・ABI 7700
・ABI 7900
・LineGene (BioFlux)
・LightCycler (Roche)
弊社の試薬で
使用実績のある機器
・Mx3000p (Stratagene)
・Thermal Cycler Dice Real Time System(TaKaRa)
・ABI 7000
・ABI 7500
・GeneAmp 5700
試薬にパッシブリファレンス色素は入っていますか?開 く閉じる

パッシブリファレンス色素は混合済みです。パッシブリファレンス色素を使用する機器類(Applied

Biosystems社等)には、そのまま使用することができます(設定はROXにしてください)。パッシブ

リファレンス色素を利用しない機器でも全く問題なく使用することができます。

 

冷蔵で保存できますか?開 く閉じる

4℃で保存することも可能です。2ヶ月程度では品質に問題が生じないことを確認しています。本試薬には

蛍光色素が含有されている為、保存の際には遮光してください。

 

凍結融解を繰り返しても大丈夫ですか?開 く閉じる

10〜20回程度の凍結融解では品質に全く問題が生じないことを確認しています。使用後は再凍結保存して

いただいても結構です。少量ずつ何度も使用する場合には、4℃で保存することも可能です。1〜2ヶ月程度

では品質に問題が生じないことを確認しています。

 

ホットスタートには対応していますか?開 く閉じる

抗Taq抗体を用いたホットスタートシステムを採用しております。化学修飾法に比べ、Taq DNA Polymerase

が迅速に再活性化するため、アッセイ時間の短縮が可能です。

 

どのようなラインアップがありますか?開 く閉じる

本試薬には、プローブアッセイ用のRealtime PCR Master Mix、SYBR® Greenアッセイ用のSYBR®

Green Realtime PCR Master Mix、および、SYBR® Green Realtime PCR Master Mix -Plus-が

あります。プローブアッセイ用では、TaqManプローブ、ハイブリダイゼーションプローブ、Molecular

Beacon等のプローブを用いることができます。SYBR® Greenアッセイ用には、SYBR® GreenⅠが

あらかじめ混合されていますので、プライマーとサンプルDNAを添加するだけで、インターカレーター

アッセイ法によるリアルタイムPCRを実施することができます。また、SYBR® Green Realtime PCR

Master Mix -Plus-は、バッファー組成を改良することにより、リアルタイムPCRのリライアビリティ(信頼性)

を向上させた試薬です。

こちらに各製品の特長の一覧表がございますので、併せてご覧ください。

 

Realtime PCR Master Mixとはどのような試薬でしょうか?開 く閉じる

汎用性の高いTaq DNA polymeraseをベースとして開発されたリアルタイムPCR用マスターミックスです。

本試薬では、RT産物(cDNA)あるいはゲノムDNAを鋳型としてリアルタイムPCRを実施することが可能です。

 

1step RT-PCRに使用できますか?開 く閉じる

Realtime PCR Master Mix、および、SYBR® Green Realtime PCR Master Mixでは、逆転写酵素

ReverTra Ace(Code No.:TRT-101)とRNase Inhibitor(Code No.:SIN-101(Native type)、

Code No.:SIN-201(Recombinant type))の組み合わせにより、RNAサンプルを鋳型とした1step

RT-PCRが可能です。

 

キャリーオーバーに関して注意点はなんですか?開 く閉じる

リアルタイムPCRでは、増幅産物の持ち越し(キャリーオーバー)による偽陽性も注意すべきポイントの

一つです。電気泳動と試薬調製は離れた場所で、別のピペットを用いて行いましょう。また、コントロール

配列を挿入したプラスミドの抽出作業なども危険な作業の一つですので必ず離れた場所で行ってください。

試薬調製時には、手洗いや手袋着用を忘れずに。
また、リアルタイムPCR後のサンプルは溶液を取り出さずにそのまま廃棄されるのが無難です。