KOD FX Neo 実施例9
ES細胞での遺伝子組換え判定

【データご提供】

群馬大学先端科学研究指導者育成ユニット
山本 正道 先生




【サンプル】ES細胞のゲノムDNA

【サンプルの処理】
ES細胞をProKにて溶解した後、フェノール/クロロフォルム→クロロフォルム→イソプロパノール沈殿を行った後にTE溶液にて溶解した。

【遺伝子名】ROSA26領域に特定のcDNAをknock-inしている

【ターゲット長】7011bp

【反応条件】
DW                                    11-X  μL
2XBuffer  for KOD FX Neo      25   μL
2mM dNTPs                            10   μL
10 pmol/ml  Primer F               1.5 μL
10 pmol/ml  Primer R               1.5 μL
Template DNA                         X    μL
KOD FX                                   1    μL    
                          50   μL


【PCRサイクル】

KOD FX Neo:


※その他の試薬においては、取扱説明書に従い最適な条件にて実施した


【コメント】

 KOD FX Neoを用いた場合は通常のPCR条件(3-step cycle)でも検出可能だが、step-downのPCR条件にするとはっきりと検出可能である。対してA社高効率PCR酵素を用いた場合、今回は検出可能であったが、検出できる場合とできない場合がある。これはDNA量と酵素量に依存する感触を持っている。A社高効率PCR酵素は推奨量よりも2.5倍程度増量すると検出可能になるようである。A社Long PCR酵素では全く検出できない。