実施例

KOD -Multi & Epi- 実施例3 バイサルファイト処理DNAの増幅効率の比較

メチル化されてないシトシン(C)は、バイサルファイト処理によりウラシル(U)に変換されるため、PCR後にシーケンス解析により、メチル化されたCを区別することができます。この処理により、ターゲットの配列はATリッチとなり、また断片化されるため、一般的にバイサルファイト処理されたDNAの増幅は難しいとされています。

この検討では、バイサルファイト処理を行ったJurkat 細胞由来のメチル化DNAを鋳型として使用し、900～1500bpの増幅を種々のDNAポリメラーゼで比較しました。その結果、KOD -Multi & Epi-®は約1.5 kb までのターゲットについて良好な結果を示しました。さらに、1583bpの増幅産物に関して、クローニングキット(TArget CloneTM -Plus-)を用いてクローニングした後に、シーケンス解析を行い、バイサルファイト変換されたターゲットが増幅されていることを確認しました(データ示さず)。

また、TGFβ(917bp)について、テンプレート量の検討を行いました。その結果、5ngまで検出することが可能でした。バイサルファイト処理を行うことにより、DNAが断片化されることが知られていますが、そのようなサンプルを用いた場合においても、KOD -Multi & Epi-®を用いて約1kbのターゲットを高感度で検出することが可能でした。



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