Can Get Signal 実施例4
HEK293Tの新規癌遺伝子産物MM-1αの検出(ウェスタンブロット)

【データご提供】
北海道大学生命科学院分子生物学分野



 【実験方法】

  ●サンプルの由来と調製法
  MM-1α
  【由来】HEK293T(培養細胞)
  【調製法】HEK293T をRIPA buffer にて可溶化


  GST-FLAG-MM-1α
  【調製法】GST融合タンパク質として精製

  ●ブロッティング方法:ウェット法

  ●メンブレンのブロッキング
   1. ブロッキング溶液 :5% Skim Milk in PBS
   2. インキュベート温度 : 室温
   3. インキュベート時間 : 2時間

●抗体反応
<1次抗体>
 1. メーカー名 :Abnova
 2. 商品名 :PFDN5 polyclonal antibody
 3. 希釈倍率 :1/1000
 4. 希釈溶液 :5% Skim Milk in PBS or
        Can Get Signal® Solution1
 5. インキュベート温度    : 室温
 6. インキュベート時間    : 4時間


<2次抗体>
  1. メーカー名 :Invitrogen
  2. 商品名 :Alexa Fluor 680 donkey anti-rabbit
        IgG (H + L)
  3. 希釈倍率 :1/6000
  4. 希釈溶液 :5% Skim Milk in PBS or
        Can Get Signal® Solution2
  5. インキュベート温度    : 室温
  6. インキュベート時間    : 1時間

 ●シグナルの検出
LI-COR 社Odyssey システムにより蛍光検出


【結果・コメント】
私の所属する研究室で同定された新規癌抑制遺伝子産物MM-1α/Prefoldin 5 の抗体を購入し、内在性または
リコンビナントのMM-1α をWestern blot において検出可能かどうかを確認していたところ、従来の抗体の
PBS 希釈では細胞をサンプルとした場合の内在性のMM-1αのシグナルは全く検出されず、リコンビナントの
MM-1αでもわずかにバンドが確認される程度でしたが、 Can Get Signal® を用いた場合では明らかに
シグナルの強度が増し、内在性のものでも十分にバンドが確認されるようになりました。 現在はブロッキング
を十分に行うことで*、少量のタンパク質Lysate を泳動した場合においても十分なシグナルを検出することが
出来ており、大変満足しています。他の抗体を使用する際にも、 Can Get Signal® を用いることでシグナル
が強くなるか否かを確認してから、実験を進めるようにしています。

*ブロッキングの工夫
ブロッキングに関しては、用いる5% スキムミルクの液量を増加させ、振倒をより穏やかに長時間(2hr→4hr)
行うように変更いたしました。また、TOYOBOのHPに記載されております『私にもできた!ライフサイエンス
実験シリーズ ウェスタンブロッティング・免疫染色編
』を参考に、ブロッキング→抗体付加の間にTBS-T
での十分な洗浄操作を加えるようにいたしました。それまでは、ブロッキング後にすぐCan Get Signal®
用いておりましたが、洗浄を行うことでブロッキング液の持ち越しなしに抗原抗体反応を行えたのでは
ないかと思っております。このようにHP を参考にさまざまな操作方法を変更したため、どの過程が
効果的に作用したのかは定かではありませんが、良いMM-1αの抗体が無い中で検出方法を試行錯誤していた
なか、HP に記載されている情報はとても有難いものでした。


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