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逆転写のご質問【ReverTra Ace qPCR RT Master Mixシリーズ】

従来品のReverTra Ace qPCR RT Kit とはどこが違うのですか?開 く閉じる

従来品では 5x RT Buffer、Enzyme Mix、Primer Mix に分かれていたパーツが 1本の5x RT Master Mixになりました。(性能は変わりません。)

ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Removerは、どのような場合に使用する
のですか?開 く閉じる

ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (FSQ-301)には、ゲノム除去試薬が添付されており、逆転写反応前に鋳型RNAを処理することによって、ゲノムフリーのcDNAを調製することができるため、ターゲットに偽遺伝子が存在する場合や、イントロンをまたぐ位置にプライマーを設定できない場合など、ゲノムDNAの残存が問題となるリアルタイムPCR実験に有効です。

RT-PCRやクローニングにも用いることができますか開 く閉じる

本キットを用いて合成されるcDNAは短鎖cDNAの割合が高いため、長鎖のRT-PCRやクローニング用途には向きません。そのような用途には、ReverTra Ace -α- をお薦めいたします。

リアルタイムPCR用の試薬はどのようなものを使用すれば良いですか?開 く閉じる

各社から販売されている各種リアルタイムPCR用試薬を用いることが可能です。

RNase H処理は必要ですか?開 く閉じる

鋳型RNAの残存によってPCRが阻害されることがあるため、一般的には逆転写反応終了後にRNase Hによる鋳型RNAの分解反応を行いますが、本キットでは、弊社が開発した新システムにより鋳型RNAは逆転写反応後に非酵素的に除去されます(特許出願中)。逆転写反応後にRNase H処理を行う必要はありません。

鋳型RNAはどのようなものが使用できますか?開 く閉じる

Total RNA、mRNA、tRNA、rRNAなど、各種RNAを用いることが可能です。

反応時間を延長することでcDNA合成量は向上しますか?開 く閉じる

tRNAなど、多量のRNAを完全に逆転写する場合には、反応時間を延長することで収量が向上することがありますが、通常は標準推奨条件の37℃15分で十分です。

5×RT Master Mix に含まれるPrimer Mixとはどのようなものですか?開 く閉じる

リアルタイムPCRに適したcDNAを効率よく合成できるようにRandom primerとOligo(dT) primerとを最適な比率で混合したものです。このPrimer Mix を用いることにより、さまざまな検出ターゲットに対し、条件検討を行うことなく再現性よく高効率に逆転写反応を行うことができます。

遺伝子特異的プライマー(Gene Specific Primer)を使用したい場合は、どのようにすればよいですか?開 く閉じる

遺伝子特異的プライマーを用いることはできません。遺伝子特異的プライマーをご使用される場合は、ReverTra Ace qPCR RT Kit (Code No.FSQ-101)をご使用ください。

高次構造を取りやすいRNA の場合、どのようにすればよいですか?開 く閉じる

逆転写反応を行う前に、RNA を65℃で5 分間インキュベートし、氷上で急冷してから使用してください。
また、37℃,15 分間の逆転写反応の後に、50℃, 5 分間の反応を追加することで、回避できる場合もあります。

ゲノムDNA除去を行った場合、DNaseが含まれている状態で、cDNA合成反応に移行しますが、
作成したcDNAが分解されないのですか?開 く閉じる

5×RT MasterMix II が DNase の反応を阻害する組成になっており、逆転写反応中にDNA-RNAハイブリッドが分解されないようにしております。
逆転写反応後、98℃、5minの熱処理のステップでDNase は逆転写酵素と一緒に完全に失活します。

FSQ-301のRT Master Mix II の代わりにFSQ-201のRT Master Mixを使用することは可能ですか?開 く閉じる

RT Master Mix II は4x DN Master Mix (gDNA Remover混合済み)への添加が前提で、FSQ-201のRT Master Mixとは異なる組成となっているため、代用できません。

gDNA Remover混合済みの4×DN Master Mixは保存できますか?開 く閉じる

-20℃にて少なくとも3ヶ月間は安定に保存することができます。

4×DN Master MixとgDNA Remover は別売りがありますか?開 く閉じる

販売しておりません。

5×RT Master Mix II no RT Control は別売りがありますか?開 く閉じる

5×RT Master Mix II no RT Control(Code No.FSQ-301NC 1ml×1本 ¥10,000)として販売しております。