DNA末端平滑化プロトコール


以下のプロトコールのDNAの末端の平滑化には、「KOD DNA Polymerase (Code No. KOD-101)」、ライゲーションには、「Ligation high (Code No. LGK-101)」をご使用いただけます。

(1) 平滑化反応液を以下の通り調製します。
反応液を調製する前に各試薬を十分攪拌してからご使用ください。凍結している試薬は完全に融解してください。

 Components

Volume 

 Final Concentration

 Sample DNA

Xμl 

 

 10x Buffer #1*

1 μl 

 1x

 2mM dNTPs*

1 μl 

 0.2mM each

 25mM MgCl2*

0.6μl 

 1.5mM

 KOD DNA Polymerase (2.5U/μl)*

1 μl 

 2.5 U/10μl

 Autoclaved,distilled water

to 10 μl 

 

*: KOD DNA Polymerase (Code No. KOD-101)のパーツです。 

全ての液を添加した後、反応液をボルテックスなどで十分攪拌してからサーマルサイクラーに
セットしてください。

(2) 72℃、2minインキュベートします。

(3) 氷中で冷却します。

(4) 反応液をそのままライゲーション反応に使えます。

     (ライゲーション反応の例)

 Components

Volume 

 平滑化したSample DNA

Yμl 

 TEバッファー

10-Yμl

 Ligation high (Code No.LGK-101)

10μl

     16℃、1hrインキュベートします。

 

※平滑化処理をうまく行うために
① エタノール沈殿などで、TEバッファーに置換したDNAの使用を標準的な操作としていますが、
次の方法でも可能です。
・制限酵素処理したDNAの場合:H,M,L,TAバッファーを用いた反応液であれば、反応液を
 そのままDNA溶液として用い、上の反応組成で平滑化処理できます。
・TaqでPCRした産物の場合:PCR後の反応液を一部取り、KODを添加し、72℃,2min処理します。
このとき、KODは、Taqと同じUnit数を加えます。dNTPsは、反応時の濃度で0.2mMが
至適ですので、不足している場合は追加します。
10X Buffer #1、25mM MgCl2、2mM dNTPsの添加は必要ありません。


② DNA末端10pmolを処理できます。直鎖状pUC18 DNA2.7kbであれば、約10μgに相当します。
DNA溶液は、最高6.4μlまで処理できます。


③ 反応液を調製するとき、KODを最後に加えてください。dNTPsが共存しない環境下ではKODの3'→5’exonucleaseが強く作用し、過剰にDNAを削ることがあります。

④ 72℃,2minで充分な平滑化反応が行われます。また、標準の反応条件であれば、30minまで
時間を延長しても効率は変わりません。