実施例

KOD FX 実施例27 緑膿菌DNAの遺伝子増幅

【サンプル】緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa K767)の染色体DNA^*

【遺伝子名】PA5471

【ターゲット長】約1.5 kb

【プライマー配列^*】
Primer F:5’-GCTAGAATTCGATCTACCGTTTCAATCACATGGAT-3’
Primer R:5’-GATCTCTAGAGGCCACCTCCTCGATTACCT-3’

* 参考文献
Morita Y, Sobel ML, Poole K.J Bacteriol. 2006 Mar;188(5):1847-55.

【反応液組成】
<KOD FXの場合>
PCR grade water  　  　 　  0.8 μL
2 × PCR buffer for KOD FX　5 μL
2 mM dNTPs   　　  　   　   2 μL
4 μM Primer F  　　　           0.75 μL
4 μM Primer R                         0.75 μL
鋳型DNA*                                0.5 μL
KOD FX(1.0 U/μL)                  0.2 μL
---------------------------------------------
Total                                    10μL

<A社汎用酵素の場合>
PCR grade water                 6.16 μL
10 × ExTaq buffer               1 μL
10 mM dNTPs                     0.8 μL
4 μM Primer F                     0.75 μL
4 μM Primer R                     0.75 μL
鋳型DNA*                             0.5 μL
A社汎用酵素(5 U/μl)          0.04 μL
---------------------------------------------
Total                                  10μL

※約5 μg/μLの濃度の緑膿菌染色体DNAを100倍ずつ連続的に希釈して用いた。
　 DMSOを用いた場合、4 %となるようにDMSOを添加した。
         
【PCRサイクル】
94 ℃　2 min.
↓
(94 ℃ 15 sec.,60 ℃ 30 sec.,68 ℃ 2 min.)35 cycles
↓                 
68 ℃　5 min.

【結果】


【データご提供】
愛知学院大学薬学部微生物学講座
森田　雄二先生

【先生からのコメント】
KOD FXを使用した場合、DMSOを添加しなくとも、PCR産物が観察された。
DMSOを添加した場合でもKOD FXの方がより特異性の高い、強いバンドが観察された。

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