KOD FX 実施例27
緑膿菌DNAの遺伝子増幅

【サンプル】緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa K767)の染色体DNA*

【遺伝子名】PA5471

【ターゲット長】約1.5 kb

【プライマー配列*
Primer F:5’-GCTAGAATTCGATCTACCGTTTCAATCACATGGAT-3’
Primer R:5’-GATCTCTAGAGGCCACCTCCTCGATTACCT-3’

* 参考文献
Morita Y, Sobel ML, Poole K.J Bacteriol. 2006 Mar;188(5):1847-55.

【反応液組成】
<KOD FXの場合>
PCR grade water          0.8 μl
2 × PCR buffer for KOD FX  5 μl
2 mM dNTPs              2 μl
4 μM Primer F                0.75 μl
4 μM Primer R                     0.75 μl
鋳型DNA*                           0.5 μl
KOD FX(1.0 U/μl)                0.2 μl
-------------------------------------
Total                                10μl

<A社汎用酵素の場合>
PCR grade water                 6.16 μl
10 × ExTaq buffer               1 μl
10 mM dNTPs                     0.8 μl
4 μM Primer F                     0.75 μl
4 μM Primer R                     0.75 μl
鋳型DNA                          0.5 μl
A社汎用酵素(5 U/μl)             0.04 μl
----------------------------------------
Total                                10μl

※約5 μg/μlの濃度の緑膿菌染色体DNAを100倍ずつ連続的に希釈して用いた。
  DMSOを用いた場合、4 %となるようにDMSOを添加した。
         
【PCRサイクル】
94 ℃ 2 min.

(94 ℃ 15 sec.,60 ℃ 30 sec.,68 ℃ 2 min.)35 cycles
↓                 
68 ℃ 5 min.

【結果】


【データご提供】
愛知学院大学薬学部微生物学講座
森田 雄二先生

【先生からのコメント】
KOD FXを使用した場合、DMSOを添加しなくとも、PCR産物が観察された。
DMSOを添加した場合でもKOD FXの方がより特異性の高い、強いバンドが観察された。


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