(KOD FX) 実施例30

先生方からいただきましたKOD FXの使用例を掲載いたしております。実験にお役立てください。

 

 実施例14: KOD FXを用いた緑膿菌DNAの遺伝子増幅

 

【サンプル】緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa K767)の染色体DNA

【遺伝子名】PA5471

【ターゲット長】約1.5 kbp

【プライマー配列
Primer F:5’-GCTAGAATTCGATCTACCGTTTCAATCACATGGAT-3’
Primer R:5’-GATCTCTAGAGGCCACCTCCTCGATTACCT-3’

参考文献
Morita Y, Sobel ML, Poole K.J Bacteriol. 2006 Mar;188(5):1847-55.

【反応液組成】

PCR grade water**        0.8 μl
2 × PCR buffer for KOD FX 5 μl
2 mM dNTPs              2 μl
4 μM Primer F           0.75 μl
4 μM Primer R              0.75 μl
鋳型DNA*                     0.5 μl
KOD FX(1.0 U/ml)          0.2 μl
-------------------------------------
Total                            10μl


PCR grade water**          6.16 μl
10 × ExTaq buffer                1 μl
10 mM dNTPs                    0.8 μl
4 μM Primer F                  0.75 μl
4 μM Primer R                  0.75 μl
鋳型DNA*                         0.5 μl
A社汎用酵素(5 U/ml)          0.04 μl
----------------------------------------
Total                                 10μl

*約5 μg/μlの濃度の緑膿菌染色体DNAを100倍ずつ連続的に希釈して用いた。
**DMSOを用いた場合、4 %となるようにDMSOを添加した。
         
【PCRサイクル】
94 ℃ 2 min

(94 ℃ 15 sec,60 ℃ 30 sec,68 ℃ 2 min)35 cycles
↓                 
68 ℃ 5 min

【結果】
20090212KFX_U14_1.jpg

【データご提供】
愛知学院大学薬学部微生物学講座
森田 雄二先生

【先生からのコメント】
KOD FXを使用した場合、DMSOを添加しなくとも、PCR産物が観察された。
DMSOを添加した場合でもKOD FXの方がより特異性の高い、強いバンドが観察された。

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