(KOD FX) 実施例25 コロニーPCRによる酵母形質転換体の確認

 

 下記の実施例を掲載したチラシ形式のPDFファイルはコチラ からダウンロードしていただけます。
『KOD FX』のその他実施例は
コチラから

 

 実施例9:コロニーPCRによる酵母形質転換体の確認

先生方からいただきましたKOD FXの使用例を掲載いたしております。今回は酵母のコロニーダイレクトPCRでも『KOD FX』の効果が確認された実施例をいただきました。

 『Zymolyase処理バージョン』


【遺伝子名】
Xanthophyllomyces dendrorousからクローニングし、
Saccharomyces cerevisiae Y187にプラスミドの状態で導入した配列4種(A-D)

【サンプル】
上記配列を導入したS. cerevisiae Y187のコロニーをつまようじで少量とり、
Zymolyase溶液(Zymolyase 2.5 mg/ml、10 mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5、
1.2 Mソルビトール)10 μlに懸濁し、37℃  30分インキュベート。
PCR反応液を調製し、上記の液をtemplateとして1 μl加えた(total 20 μl)。

【ターゲット長】
約3000 bp

【プライマー条件】
Forward 22 mer   5’-ctattcgatgatgaagataccc-3’
Reverse 19 mer   5’-aaattgagatggtgcacga-3’

【サイクル】
KOD-FX:  94℃ 4 min
              (98℃ 10 sec,60℃ 30 sec, 68 ℃ 4 min )×30cycles
             4℃ ∞

他社酵素:推奨条件(30cycles)

20080724KFX9_1.jpg

M: 1kb DNA Ladder
1~9: A社酵素
1~9: KOD FX

1: A配列をもつプラスミドを導入したコロニー1
2: A配列をもつプラスミドを導入したコロニー2
3: B配列をもつプラスミドを導入したコロニー1
4: B配列をもつプラスミドを導入したコロニー2
5: C配列をもつプラスミドを導入したコロニー1
6: C配列をもつプラスミドを導入したコロニー2
7: D配列をもつプラスミドを導入したコロニー1
8: D配列をもつプラスミドを導入したコロニー2
9: 酵母からキットで抽出・精製したB配列をもつプラスミド(ポジティブコントロール)


上記の実験で良好な結果が得られましたので、続いてコロニーダイレクト(Zymolyase処理なし)PCRを行なっていただけました。
 

 『コロニーダイレクト(Zymolyase処理なし)バージョン』


【遺伝子名】
他種酵母のcDNAライブラリー

【サンプル】
上記cDNAライブラリーを導入したS. cerevisiae Y187を直接PCR反応液に懸濁した。

【ターゲット長】
約500~4000 bp

【プライマー条件】
Forward 22 mer   5’-ctattcgatgatgaagataccc-3’
Reverse 19 mer   5’-aaattgagatggtgcacga-3’

【サイクル】
KOD-FX:  94℃ 4 min
              (98℃ 10 sec,60℃ 30 sec, 68 ℃ 4 min )×30cycles
              4℃  ∞

20080724KFX9_2.jpg

M:   1kb DNA Ladder
1~21: KOD FX

【データご提供】
奈良先端科学技術大学院大学 細胞機能学講座 
浮辺健先生、大津厳生先生、高木博史先生


【先生からのコメント】
以前から他社のポリメラーゼを用いて酵母のコロニーPCRを行っていたが、ちょっとした条件の違い
(コロニーの年齢、使用する菌体の量)などで増えたり、増えなかったりということが頻繁に起きていた。
このKOD FXを使ってすでに100回以上コロニーPCRを行ったが、今までに増幅に失敗したことはない。
さらに、酵母菌体をZymolyaseで処理せずに(大腸菌のコロニーPCRと同様に)、PCR溶液に直接菌体を加える方法でも問題なく増幅できる。


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