(KOD FX) 実施例14 マウステール溶解液を直接用いたトランスジェニックマウスのジェノタイピング

 

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【目的】
マウステール溶解液を直接用いて、トランスジェニックマウスのジェノタイピングを行い、
ホモ/ヘテロの判定を行いました。挿入された遺伝子の周辺の配列は以下のようになります。

20081017KFX_HH_1.jpg
 

 ※本実験で使用したトランスジェニックマウスのマウステール、及びプライマー情報は
   国立循環器病センター・荒井勇二先生よりご供与いただきました。


【方法】
1.マウステール Lysateの調製(アルカリ溶解法を使用)
マウステールは以下のように簡便法(アルカリ溶解法)を用いて処理し、
上清1 μlをPCR反応に使用しました。

【アルカリ溶解法】
20080812mouse_tail_2.jpg

2. PCR 
KOD FX(TOYOBO)
<反応条件>
2x PCR buffer for KOD FX       25 μl
2mM dNTPs                         10 μl
10pmol /μl Primer #1            1.5 μl
10pmol /μl Primer #2            1.5 μl
マウステールLysate                  1 μl
PCR grade water                  10 μl
KOD FX (1.0U/μl)                   1 μl 
-----------------------------------------------     
Total reaction volume            50 μl


94℃ 1min.
(98℃ 10sec.,68℃ 3min.)×30cycles

●A社高効率PCR酵素 
<反応条件>
推奨条件を使用


(98℃ 10sec.,68℃ 3min.)×30cycles

●B社Long PCR酵素 
<反応条件>
推奨条件を使用


94℃ 1min.
(98℃ 10sec.,68℃ 3min.)×30cycles
72℃ 10min.

【結果】
PCR産物を、1%アガロースゲルに5μlをアプライして解析を行いました。
その結果、KOD FXを用いた場合のみ、すべてのタイプで解析が可能でした。
20081017KFX_HH_2.jpg
 

KOD FXはその他、血液、植物サンプル(葉、米粒)、酵母などから精製なしに
PCR増幅することが可能です!
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