(KOD FX) 実施例13 植物サンプル(葉・米粒)からのPCR増幅例

 

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これまで直接の増幅が困難だった植物の葉や精米サンプルについて、ワンステップ法で調製したライセートを鋳型として、KOD FXを用いる増幅を検討しました。

「前処理方法」
20080812Plant_flow.jpg

【遺伝子名】 rbcL

【サンプル】  トマト葉、タバコ葉、イネ葉、精米

【ターゲット長】  約1.3 kb

【プライマー配列】
Primer F1:5’-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’ (トマト&タバコ用)
Primer R1:5’-AAGCAGCAGCTAGTTCCGGGCTCCA-3’ (トマト&タバコ用)
Primer F2:5’-ATGTCACCACAAACAGAAACTAAAGC-3’ イネ用
Primer R2:5’-AAGCTGCGGCTAGTTCAGGACTCCA-3’ イネ用

【サイクル】 
   94°C  2 min.
   (98°C 10 sec. 68°C 1.5 min.)×30cycles
※プライマーのTm値が72℃未満の場合は、3ステップで行います。
 

【PCR組成】

   滅菌蒸留水                              10<μl>
   2x PCR Buffer for KOD FX         25
   2mM dNTPs                   10 (0.4 mM)
   10 pmol/μl F                        1.5
   10 pmol/μl R                         1.5
  KOD FX (1U/μl)                    1(1U)
   ライセート(ワンステップ法)             1   
   ----------------------------------------------
  Total                                  50 μl 


【結果】

20080812plant_zu1.jpg

【コメント】
本方法を用いることで、トマト、タバコ、イネの葉、及び精米のライセートをサンプルとして、明瞭な増幅が認められました。増幅は、KOD FXを用いたときのみ認められたことから、ワンステップ法とKOD FXを組み合わせることで、植物の遺伝子解析を簡素化できると思われます。

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