(KOD FX) 実施例6 真核細胞最長DMD遺伝子(13.5Kb)のPCRクローニングに挑戦


ヒトジストロフィン(DMD)遺伝子は、真核細胞における最も長いmRNAの一つです。ここでは、KOD FXを用いて本遺伝子の全長クローニングを行った例をご紹介します。

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逆転写反応
1st  Strand 合成キット:ReverTra Ace -α-®(Code No.:FSK-101)
 RNA :Human Adult Skeletal Muscle total RNA (Code No.:CA1H60) 1μg / 20μl反応系
逆転写Primer: Oligo (dT)20 primer(Code No.:FSK-201)

KOD FXを用いたPCR 
Primer F: GATGGCCTTGTTGGCCTACTGGAGCAATAAAGTTTGAAGAACTTTTACCAGG
Primer R: GACGGCCTATGTGGCCACAACACGAAATAATGTCCAAATTAATTATGC (下線部はSfi Iサイト)

アガロースゲル電気泳動による増幅産物の確認

残りのPCR増幅産物をMagExtractor™ -PCR & Gel Clean up-(Code No.:NPK-601)を用いて精製

制限酵素Sfi I(Code No.:SFI-111)によるPCR産物の消化   

アガロースゲル電気泳動による分離、切り出し、DNA回収

予めDra IIIでカットしたPlasmid Vector pME13SFL3とligation

大腸菌コンピテントセルDH5α(Code No.:DNA-903)を形質転換

形質転換体4クローンをシーケンシングにより配列確認

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<結果> 
シーケンシングの結果、5クローン中1クローンにおいて、PCRエラーによる変異のないDMD遺伝子の全長を取得することができました。


KOD FXの正確性について・・・
KOD FXのPCRエラーによるミス塩基の取り込み頻度(エラー率)は、実際にシーケンシングにて解析した144,535塩基中、わずか19塩基でした。このエラー率は、Taqや他社Long PCR用酵素の約10倍優れています。
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※KOD -Plus- Ver.2の正確性はKOD -Plus- とほぼ同等です。
各酵素にてヒトゲノムDNAを鋳型にβ-globin領域2.4kbの増幅を行い、PCR産物をTAクローニング後、96クローンをピックしてシーケンシングを行い、配列の確認を行いました。