実施例

KOD SYBR™ qPCR Mix 実施例8 クルードサンプル(菌液)を用いたリアルタイムPCR

【データご提供】日本大学 薬学部 ゲノム創薬学研究室 小林 秀昭 先生

【実験結果】 
1. 精製DNAと菌液の増幅曲線

　　赤:精製DNA
　　緑:菌液

 

 

 

菌液の増幅曲線の傾きは、精製DNAのものとほぼ一致した。

2. 精製DNAと菌液の融解曲線

赤:精製DNA
緑:菌液

菌液の融解曲線のパターンは精製DNAのものとほぼ一致した。ピークは同じTmを示し、副生成物もほとんど生じていなかった。

【サンプル】菌液

【サンプルの調製方法】
昆虫の一部の組織を摘出。すり潰して内部に存在する菌を回収。

【遺伝子名】B

【ターゲット長】約600 bp

【プライマー】
     Primer1:24 mer, Tm 60℃、Primer2:24 mer, Tm 58℃

【比較対象】精製DNA

【反応条件】
KOD SYBR™ qPCR Master Mix	5   μL
Primer1 (10 μM)	0.2μL
Primer2 (10 μM)	0.2μL
50×ROX reference dye	0.2μL
Template	1   μL
DDW	3.4μL
Total	10   μL

【PCRサイクル】
 98℃, 2 min.
     ↓
 (98℃, 10 sec. - 60℃, 10 sec. - 68℃, 30 sec.) × 40 cycles
     ↓
 melt curve

【測定機器】StepOne Plus (ライフテクノロジーズ)

【コメント】
精製DNAとの比較で、菌液でも副生成物がほとんど見られず、Tmも一致し、増幅曲線の傾きもほぼ一致したことから、KOD SYBR™ qPCR Mixは菌液などのクルードサンプルからの増幅、例えばコロニーPCR、に利用できると考えられた。

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