KOD SYBR qPCR Mix実施例3
クルードサンプルを用いたリアルタイムPCR

【データご提供】日本大学 薬学部 ゲノム創薬学研究室 小林 秀昭 先生

【実験結果】 
1. 精製DNAと菌液の増幅曲線




  :精製DNA
  :菌液



 

 

 




菌液の増幅曲線の傾きは、精製DNAのものとほぼ一致した。

2. 精製DNAと菌液の融解曲線









:精製DNA
:菌液















菌液の融解曲線のパターンは精製DNAのものとほぼ一致した。ピークは同じTmを示し、副生成物もほとんど生じていなかった。

【サンプル】菌液

【サンプルの調製方法】
昆虫の一部の組織を摘出。すり潰して内部に存在する菌を回収。

【遺伝子名】B

【ターゲット長】約600 bp

【プライマー】
     Primer1:24 mer, Tm 60℃、Primer2:24 mer, Tm 58℃

【比較対象】精製DNA

【反応条件】
  KOD SYBR® qPCR Master Mix  5  μL
  Primer1 (10 μM)                    0.2μL
  Primer2 (10 μM)                    0.2μL
  50×ROX reference dye           0.2μL
  Template                               1  μL
  DDW                                     3.4μL  
  計                                       10   μL

【PCRサイクル】
 98℃, 2 min.
 ↓
 (98℃, 10 sec. - 60℃, 10 sec. - 68℃, 30 sec.) × 40 cycles
 ↓
 melt curve

【測定機器】StepOne Plus (ライフテクノロジーズ)

【コメント】
精製DNAとの比較で、菌液でも副生成物がほとんど見られず、Tmも一致し、増幅曲線の傾きもほぼ一致したことから、KOD SYBR® qPCR Mixは菌液などのクルードサンプルからの増幅、例えばコロニーPCR、に利用できると考えられた。