Can Get Signal immunostain 実施例10
ST2細胞におけるリソソームマーカーLAMP-1の検出

【データご提供】
東京大学 医学部附属病院 薬剤部 試験研究室
青木 重樹先生、苅谷 嘉顕先生

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1%BSAを抗体希釈に使用した際に比べ、 Can Get Signal® immunostain Solution Aを希釈に使用した場合は、バックの上昇に伴うS/N比の低下が起こる傾向にあった。一方で、 Can Get Signal® immunostain Solution Bを使用した場合には、バックの低下、シグナルの増大が見られ、S/N比が大幅に改善する傾向にあった。このことから、ST2細胞におけるリソソームマーカータンパク質LAMP-1の染色には、 Solution Bが適していると考えられる。想像以上の改善が見られ、今後、当研究室での通常のプロトコール(1% BSA/PBS)での免疫細胞化学染色の際に問題が発生した際には、使用を検討してもよいと思っている。
 

【実験方法】
 (1)サンプルの由来:ST2細胞 (マウス骨髄由来ストローマ細胞)
 ※抗原タンパク質の発現誘導の有無:なし

 (2)サンプル:Tissue Cultured Cells

 (3)サンプル調製方法
   細胞をglass base dish上にまいて培養 
   →PBSで2回wash
   →4%PFAで室温30分固定
   →PBSで3回wash
   →0.01%Triton X-100でon ice5分の透過処理
   →PBSで3回wash

 (4)ブロッキング、内因性ペルオキシダーゼ活性阻止
 1. ブロッキング溶液:1% BSA/PBS
 2. インキュベート温度:室温
 3. インキュベート時間:1時間
 4. 内因性ペルオキシダーゼ活性阻止: なし

 (5)抗体
 <1次抗体>
 1. メーカー名:Sigma Aldrich
 2. 商品名:Rabbit anti LAMP-1
 3. 希釈倍率:1/400
 4. 希釈溶媒:1% BSA/PBS or Can Get Signal® immunostain Solution A or B
 5. インキュベート温度:37℃
 6. インキュベート時間:1時間

 <2次抗体>
 1. メーカー名:GE healthcare bioscience
 2. 商品名:Alexa Fluor(R) 488 donkey anti rabbit IgG
 3. 希釈倍率 :1/400
 4. 希釈溶媒:1% BSA/PBS or Can Get Signal® immunostain Solution A or B
 5. インキュベート温度 :室温(遮光)
 6. インキュベート時間:時間

 (6)発色方法・検出方法
 Immunofluorescence(IF)