Can Get Signal immunostain 実施例9
ウシ受精卵における熱ショックタンパク質の発現と局在解析

【データご提供】
(独)農業・食品産業技術総合研究機構 
九州沖縄農業研究センター 暖地温暖化研究チーム
高橋 昌志先生

【結果・コメント】
ウシ8日目胚盤胞におけるHSP70の局在検出

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今回、胚の成長と増殖の指標候補タンパク質として遺伝子発現の変動が報告されている牛着床前の胚盤胞におけるHSP70の局在検出を行った。当研究室にて実施している染色プロトコールとCan Get Signal® immunostain Solution AおよびBによる比較を行ったところ、従来法と比較してSolution A、B共にHSPの強い蛍光画像が得られた。Solution A とBとの比較ではSolutionBの方で蛍光が強くなり、 Solution A では従来法より若干明瞭であった。また、蛍光二次抗体に同液を使用しても非特異的な蛍光像は観察されなかったため、一次抗体の抗原への結合が増感されたことにより明瞭な画像となったと考えられる。
 

【実験方法】
 (1)サンプルの由来:ウシ受精卵:胚盤胞期胚
 ※抗原タンパク質の発現誘導の有無 :なし

 (2)サンプル調製法:4%パラホルムアルデヒド固定ホールマウントサンプル
  受精卵の固定後、実体顕微鏡下でホールマウントにて各種染色処理を実施

 (3)ブロッキング
 1. ブロッキング溶液:1%BSA in PBS
 2. インキュベート温度:室温
   3. インキュベート時間:1時間

 (4)抗体
 <1次抗体>
   1. メーカー名:StressGen
   2. 商品名:Rabbit Anti-HSP70(Hsp72) polyclonal Antibody
   3. カタログNo.:SPA-812
   4. 希釈倍率:1/3000
   5. 希釈溶液:PBS+0.05% Tween20 or
                       Can Get Signal® immunostain Solution A or B
   6. インキュベート温度:4℃
   7. インキュベート時間:O/N

 <1次抗体の検出方法>
   2次抗体を使用

  <2次抗体,検出用キット>
   1. メーカー名:EY Laboratories
   2. 商品名:Goat anti-Rabbit IgG FITC
   3. カタログNo.:FA-2307-2
   4. 希釈倍率 :1/5000
   5. 希釈溶液: PBS+0.05% Tween20 or
                       Can Get Signal® immunostain Solution A or B

   6. インキュベート温度:室温
   7. インキュベート時間:1時間
 
 (5)発色方法・検出方法
  Immunofluorescence(IF)