Can Get Signal immunostain 実施例6 アフリカツメガエルの卵巣染色での従来法との比較検討(免疫染色)
【データご提供】
兵庫県立大学大学院 生命理学研究科
織井 秀文先生
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【実験方法】
(1)サンプルの由来:アフリカツメガエルの卵巣
(2)サンプル調製法:Paraffin Embedded Section
(3)実験フロー
1. ブアン氏の固定液による固定
2. エタノール/ブタノールによる脱水
3. パラフィン包埋
4. 6マイクロメートルの切片作製、マツナミMASコート付きスライドガラスへ添付
5. エタノール系による脱パラフィン
6. 沸騰10mMクエン酸バッファーpH6に浸しそのまま室温まで放置(抗原の活性化)
7. 10%ヤギ血清(GIBCO)、0.1%トリトンX-100/PBS(-)(ブロッキング液)にて室温30分
ブロッキング
8. 1次抗体(上記ブロッキング液 or A液or B液で400倍希釈)、室温4時間
9. 0.1%トリトンX‐100/PBS(‐)で室温、20分、3回洗う
10. 2次抗体(上記ブロッキング液で800倍希釈)、室温O/N (12時間)
11. 0.1%トリトンX‐100/PBS(‐)で室温、20分、3回洗う
12. 100mM トリス-塩酸pH9.5/100mM NaCl/50mM MgCl2、室温15分
13. BCIP/NBTによる発色 室温1時間
(4)ブロッキング
1. ブロッキング溶液名:10%ヤギ血清(GIBCO)、0.1%トリトンX-100/PBS(-)
2. インキュベート温度:室温
3. インキュベート時間:30分間
(5)抗体
<1次抗体>
1. メーカー名:自家調製
2. 大腸菌で大量に発現させたアフリカツメガエルDEADSouth遺伝子産物のC末端部分を抗原
としてマウスに注射することで得た抗血清
3. 希釈倍率:1/400
4. 希釈溶媒 上記(4)のブロッキング液 or Can Get Signal® immunostain A or B
5. インキュベート温度:室温
6. インキュベート時間:4時間
<1次抗体の検出方法>
2次抗体を使用
<2次抗体,検出用キット>
1. メーカー名:Cappel
2. 商品名:Alkaline Phosphatase 標識Anti IgG (H+L) , Mouse (Goat)
3. 希釈倍率:1/800
4. 希釈溶媒:上記(4)のブロッキング液
5. インキュベート温度:室温
6. インキュベート時間:O/N
(6)発色方法・検出方法
BCIP/NBTによる発色
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【結果・コメント】
抗DEADSouth 抗体によるアフリカツメガエル卵母細胞の染色像ミトコンドリア・クラウドと呼ばれる領域(赤矢印)が染色される。 左から、従来法、Can Get Signal® immunostain Solution A使用時、Solution B使用時。
確かに、宣伝文句どおりの増感効果が認められて驚きました。
今回は、比較のために1次抗体の希釈にのみCan Get Signal® immunostain を用いましたが2次抗体にも用いればさらに効果が見込まれると思います。また今回のサンプルではA、Bとも増感効果が認められたものの、Aではバックグラウンドが高く適していないこともわかりました。蛍光による検出を行えば写真撮影の露出時間でより定量的に増感効果を論じることができたと思いますが、呈色反応による検出においてもその差は歴然でした。この試薬を用いた抗体の希釈濃度の検討も今後試みたいと思います。また、in situ hybridizationにおいてもその効果を試してみたいものです。
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