KOD One 実施例18
フミン酸耐性の確認

フミン酸(humic acid)とは、腐植土や土壌などに存在する赤褐色または黒褐色の有機物であり、PCRを阻害することが知られています。通常行われるDNAの精製ではこのフミン酸は除くことはできません。そのため、環境・生態系サンプルを鋳型としたPCRはとても難しいとされています。
そこで KOD One® PCR Master Mix および各種PCR酵素を用い、フミン酸含有下でヒトゲノムからHBg遺伝子の増幅確認を行いました。

【サンプル】 ヒトゲノムDNA

【ターゲット遺伝子名と長さ】
 HBg /  1.3kb

【プライマー配列】
  Forward Primer :  TTAGGCCTTAGCGGGCTTAGAC
  Reverse Primer :  CCAGGATTTTTGATGGGACACG

【反応条件】   

  (1) 反応液組成        (μL)   (2) サイクル条件  
    滅菌蒸留水  Y      98℃, 10sec. 30cycles
    KOD One® PCR Master Mix 10      60℃,  5sec.
    10pmol/μL Primer F  0.6      68℃,  7sec.
    10pmol/μL Primer R  0.6      (5sec. / kb)    
    OD280=1 フミン酸  X        
    4ng/μL ヒトゲノムDNA  1  

KOD One® PCR Master Mix以外のPCR酵素は、それぞれ推奨の条件にて実施しています。

   
    Total Volume 20  

【結果】   
KOD One® PCR Master Mix を用いた場合は、フミン酸の量にかかわらず増幅が見られ、高速PCR条件下においても高いフミン酸耐性を示す結果となりました。


M : 1kb DNA Ladder

フミン酸添加量(X)
Lane 1 : 0μL,  Lane 2 : 1μL,  Lane 3 : 2μL, Lane 4 : 3μL,  Lane 5 : 4μL,  Lane 6 : 5μL, Lane 7 : 6μL, 
Lane 8 : 7μL

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