KOD -Multi & Epi- 実施例6
イノシンを含むプライマーを用いた1-step RT-PCRによるノロウイルス遺伝子の増幅

本実施例は、大阪健康安全基盤研究所 左近直美先生に監修いただきました。

KOD -Multi & Epi-®と逆転写酵素を組合わせ、1-step RT-PCR を実施しました。
イノシンを含むプライマーを用いても増幅を確認することができました。

<背景>
ノロウイルスは感染性胃腸炎を引き起こすウイルスです。感染性が非常に強く、集団発生がしばしば報告されています。このウイルスは、遺伝子変異や遺伝子組換えを起こすことが知られ、流行株の判定や集団感染における感染源特定などで、配列解析が行われます。この解析において、近年、RNAポリメラーゼとキャプシドの2領域の遺伝子型別(dual-typing)を行い、より詳細な解析を行うことが世界的な流れとなってきています。
本アッセイは、RNAポリメラーゼとキャプシドにまたがる領域を増幅し、塩基配列を決定することでdual-typingが可能です1)が、使用するプライマーにイノシンが含まれるため、 Taq DNA polymeraseを用いた増幅では増幅効率が低く、十分な感度が得られませんでした。また、従来の高効率PCR 酵素(KODやPfuなどFamily B の DNA polymerase)は、イノシンを塩基のエラーとして認識し、反応を停止させる機構があることが知られており、イノシンを含むプライマーは使用できませんでした。

ここでは、高効率酵素にイノシンの影響を受けないように改変を施した KOD DNA polymerase (UKOD)を用いたKOD -Multi & Epi-®に逆転写酵素を組合わせ、簡便な1-step RT-PCRを行うことで、前記アッセイの対象領域を増幅した例をご紹介します。


<実験方法>
【サンプルの調製方法】
ノロウイルスGI.1由来RNA、ノロウイルス GII.4由来RNAの塩基配列から、ORF1~ORF2のポリメラーゼ~キャプシド部分にあたる約700bpの配列にT7プロモーター配列を付加した遺伝子断片を人工合成しました。この合成DNAを鋳型として、ScriptMAX® Thermo T7 Transcription Kit (Code No.TSK-101)を用いてRNAを合成しました。この合成したRNAをサンプルとして、イノシンを含むプライマーで1-step RT-PCRを実施しました。 1-step RT-PCRは、弊社逆転写酵素ReverTra Ace®(Code No.TRT-101)をKOD -Multi & Epi-®に添加して行いました。

【プライマー配列】1)

  GI primer

  MON432 TGGACICGYGGICCYAAYCA

  G1SKR CCAACCCARCCATTRTACA
GII primer

MON431 TGGACIAGRGGICCYAAYCA

G2SKR CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT


【反応液組成】                                                                【RT-PCRサイクル】

     (μl)   42℃ 30sec.    
  RNase free water 17.9   94℃  2min.    
  40U/μl RNase inhibitor   0.5   98℃  10sec.
 40cycles
 
  5U/μl  ReverTra Ace®*1   0.6   50℃  30sec.
  2×PCR Buffer for KOD -Multi&Epi-® 25   68℃  30sec.
  10~20μM Forward Primer*2   2        
  10~20μM Reverse Primer*2   2  
  KOD -Multi&Epi-®   1  
  Template RNA   1            *1 ReverTra Ace® は用時に水またはバッファーで希釈
               して添加しています。
     
  Total 50            *2 Primerは0.4~0.8μM(final)でご使用できます。


<結果・考察>
イノシンを含むプライマーと逆転写酵素を加えたKOD -Multi & Epi-®を使用した1-step RT-PCRで、ノロウイルス由来RNAの増幅を確認しました。逆転写酵素を含まない系と、 KOD -Multi & Epi-®の代わりに従来の高効率PCR酵素としてKOD -Plus- Neoを使用した系では、増幅が確認されませんでした。またプライマー濃度については、0.4~0.8µMで増幅を確認しました。



<参考文献>
1) Jennifer L. Cannon, et al.  J. Clin. Microbiol. 2017 Jul 55(7) 2208-2221


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