実施例

KOD One 実施例13 初代細胞からのcDNAクローニング

データご提供 : 札幌医科大学 医学部 分子生物学講座  新沼 猛 様

<実験の目的>
遺伝子クローニング目的のPCR

<実験方法>

【サンプルの種類】
HUVEC cDNA

【サンプルの調製方法】
培養細胞より抽出したRNA 500ng を用いReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover [Code No. FSQ-301]を使用しcDNAを合成した。

【ターゲット長】
約2,200 bp

【プライマー】
Forward Primer :　長さ :  30 mer        Tm: 84 ℃
Reverse Primer :　長さ :  29 mer        Tm: 72 ℃

■KOD One^® PCR Master Mix
【反応液組成】                                                           【PCRサイクル】

		(μL)
	滅菌蒸留水	9.75		98℃  10sec.		35cycles
	KOD One® PCR Master Mix	12.5		60℃   5sec.
	10μM Forward + Reverse Primer	0.75		68℃  20sec.
	Template (HUVEC cDNA)	2
	Total Volume	25

■A社 高効率PCR 酵素
【反応液組成】                                                           【PCRサイクル】

		(μL)
	滅菌蒸留水	17.65		98℃  10sec.		35cycles
	10×PCR Buffer	2.5		60℃  30sec.
	2.5mM dNTPs	2		72℃ 120sec.
	10μM Forward + Reverse Primer	0.75
	PCR 酵素	0.1
	Template (HUVEC cDNA)	2
	Total Volume	25

■A社高速・高正確 PCR Master Mix
【反応液組成】                                                           【PCRサイクル】

		(μL)
	滅菌蒸留水	9.75		98℃  10sec.		35cycles
	PCR Master Mix	12.5		60℃   5sec.
	10μM Forward + Reverse Primer	0.75		72℃  20sec.
	Template (HUVEC cDNA)	2
	Total Volume	25

<結果・考察> 
今回のPCR結果ではKOD One使用により遺伝子全長が増幅できた。以前行った際はA社高効率PCR酵素で増幅が見られなったため、KOD Oneを使用し増幅可能であった。今回、A社高効率PCR酵素にA社高速・高正確 PCR Master Mixを加えて再度比較してみたが、A社高効率PCR酵素、高速・高正確PCR Master Mixでは増幅が見られなかった。

データは示してませんが、cDNA合成も何種類かで行いPCRを行いましたが、この領域の増幅に関してはA社高速・高正確 PCR Master Mixと同等以上だと思いました。

<感想・ご意見等>

もともとA社高速・高正確 PCR Master Mixを愛用していましたが、KOD Oneに切り替えた後もほぼ困らず実験できています。


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