KOD One 実施例13
初代細胞からのcDNAクローニング

データご提供 : 札幌医科大学 医学部 分子生物学講座  新沼 猛 様

<実験の目的>
遺伝子クローニング目的のPCR

<実験方法>

【サンプルの種類】
HUVEC cDNA

【サンプルの調製方法】
培養細胞より抽出したRNA 500ng を用いReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code No. FSQ-301)を使用しcDNAを合成した。

【ターゲット長】
約2,200 bp

【プライマー】
Forward Primer : 長さ :  30 mer        Tm: 84 ℃
Reverse Primer : 長さ :  29 mer        Tm: 72 ℃

■KOD One® PCR Master Mix
【反応液組成】                                                           【PCRサイクル】

     (μL)        
  滅菌蒸留水   9.75   98℃  10sec.   35cycles
  KOD One® PCR Master Mix 12.5   60℃   5sec.
  10μM Forward + Reverse Primer    0.75   68℃  20sec.
  Template (HUVEC cDNA)   2        
       
  Total Volume 25        

■A社 高効率PCR 酵素
【反応液組成】                                                           【PCRサイクル】

     (μL)        
  滅菌蒸留水 17.65   98℃  10sec.   35cycles
  10×PCR Buffer   2.5   60℃  30sec.
  2.5mM dNTPs   2   72℃ 120sec.
  10μM Forward + Reverse Primer    0.75        
  PCR 酵素   0.1        
  Template (HUVEC cDNA)   2        
       
  Total Volume 25        


■A社高速・高正確 PCR Master Mix
【反応液組成】                                                           【PCRサイクル】

     (μL)        
  滅菌蒸留水   9.75   98℃  10sec.   35cycles
  PCR Master Mix 12.5   60℃   5sec.
  10μM Forward + Reverse Primer    0.75   72℃  20sec.
  Template (HUVEC cDNA)   2        
       
  Total Volume 25        


<結果・考察> 
今回のPCR結果ではKOD One使用により遺伝子全長が増幅できた。以前行った際はA社高効率PCR酵素で増幅が見られなったため、KOD Oneを使用し増幅可能であった。今回、A社高効率PCR酵素にA社高速・高正確 PCR Master Mixを加えて再度比較してみたが、A社高効率PCR酵素、高速・高正確PCR Master Mixでは増幅が見られなかった。

データは示してませんが、cDNA合成も何種類かで行いPCRを行いましたが、この領域の増幅に関してはA社高速・高正確 PCR Master Mixと同等以上だと思いました。

<感想・ご意見等>

もともとA社高速・高正確 PCR Master Mixを愛用していましたが、KOD Oneに切り替えた後もほぼ困らず実験できています。


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