KOD One 実施例11
高GC配列 mouse c-Maf cDNA全長配列の増幅

データご提供 : 福島県立医科大学 医学部 放射性同位元素研究施設  関亦 正幸 先生

<実験の目的>
動物細胞発現ベクター構築のための mouse c-Maf cDNA全長配列の増幅

<実験方法>

【サンプルの種類】
マウスT細胞から抽出したtotal RNA

【サンプルの調製方法】
ISOGEN(ニッポンジーン)によりtotal RNAを調製し、その後PrimeScript RT Master mix(Perfect Real Time)(タカラバイオ)にてcDNA合成したものを鋳型に用いた。

【ターゲット遺伝子名と長さ】
mouse c-Maf cDNA / 1.2 kb 

【プライマー配列】
Forward Primer:GGGATCCGATGGCTTCAGAACTGGCAA
長さ: 27 mer                   Tm: 65.1 ℃

Reverse Primer:GGTCGACCATGAAAAATTCGGGAGAGG
長さ :27 mer                   Tm: 63.5 ℃

■KOD OneTM PCR Master Mix -Blue-
【反応液組成】                                                            【PCRサイクル】

    (μl)        
  KOD OneTM PCR Master Mix -Blue-   3   94℃   2min.    
  10μM Forward Primer    1   98℃  10sec.  
  10μM Reverse Primer    1   55℃    5sec.  30cycles
  Template   1   68℃  15sec.  
       
  Total   6        


■X社 PCR Master Mix
【反応液組成】                                                            【PCRサイクル】

    (μl)        
  PCR Master Mix   3   94℃   2min.    
  10μM Forward Primer    1   98℃  10sec.  
  10μM Reverse Primer    1   55℃    5sec.  30cycles
  Template   1   68℃  15sec.  
       
  Total   6        


 【サイクラー機種】
Bioer Technology  LifeECO ver 2.0

<結果・考察>
KOD OneはGC含量の多いc-Maf cDNAの1.2 kbを増幅することができた。X社PCR Master Mixは増幅できるがGC含量の多い領域を欠失した産物ができる。

<感想・ご意見等>
増幅配列はGC含量が70%と高く、局所的に94%を超えてGCが連続
する配列が存在している。そのため、通常のTaqポリメラーゼでは
増幅できないか、できたとしても高連続GC配列を欠失した短鎖とし
て増幅されてしまう。DMSOを添加することでPCR反応が改善されることはあるが、常に安定した結果が得られるかは不明である。比較のX社Taq系PCR Master Mixも、その中においては増幅能力の高い正確性の高い酵素であるが、図(レーン2)にあるように高連続GC配列を欠失した短鎖として増幅されている。これに対して、KOD OneTM PCR Master Mix -Blue-(レーン1)では、全長の1.2kbの増幅がメインのバンドとして検出されている。このメインバンドをクローニングし、シークエンスしたところ塩基配列が正しいことが確認できた。このことから、KOD OneTM PCR Master Mix -Blue-は、高連続GC配列の正確な増幅にも適していることが判明した。
 

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