実施例

KOD One 実施例10 酵母の遺伝子破壊の確認

データご提供 : 大阪大学大学院 歯学研究科 口腔科学フロンティアセンター 先端口腔生物学教室  荒木 保弘 先生

<実験の目的>
染色体上の標的遺伝子をマーカー遺伝子により破壊できたことを確認する。

<実験方法>

【サンプルの種類】
酵母から抽出したゲノムDNA

【サンプルの調製方法】
イエローチップの先にマッチの頭ほどのコロニーをかき取り、0.02M NaOH 50 µlへPCRチューブ内で懸濁した。
酵母懸濁液をPCRで95度10分熱処理した。

【ターゲット遺伝子名と長さ】
PIB2 / 2,345 bp     pib2::natNT2 / 1,783 bp
GTR1 / 1,128 bp    gtr1::kanMX4 / 1,679 bp

【プライマー配列】
Forward Primer  : CGGATGCTATGTCACGTTG (PIB2)               
Reverse Primer  : TCTTTACTGCTGTTGTGTCC (PIB2)

Forward Primer  : ACCCTAAATTGTGATTATGG (GTR1)                                          
Reverse Primer  : TTCTTCCTCTTATGTTTCTC (GTR1)    

【反応液組成】                                                            【PCRサイクル】

		(μL)
	滅菌蒸留水	3.9		98℃  10sec.
	KOD One® PCR Master Mix -Blue-	5		53℃    5sec.		35cycles
	10μM Primer F	0.3		68℃  10sec.
	10μM Primer R	0.3
	酵母懸濁液	0.5
	Total Volume	10

PCR反応液の半量(5μL)を用いて、電気泳動を行った。

【サイクラー機種】
Applied Biosystems^® GeneAmp^® PCR System 9700

<結果・考察>
  ・PCRの時間が大幅に短縮された。
  ・目的遺伝子の増幅効率が改善された。
  ・All in oneなのでPCR反応液の調製が容易になった。
 

<感想・ご意見等>
普段から大量のPCRをやる機会が多く、負担となっていました。しかし、KOD Oneを使うようになってから、この負担が大きく軽減しました。以前は御社のKOD製品を目的別に数種類使っていましたが、反応速度、正確性を鑑みて現在はKOD Oneのみを用いており、経済的な観点からも助かっています。

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