実施例
Blend Taq 実施例4 コロニーダイレクトPCRによるインサートチェック
大腸菌コロニーを鋳型とするインサートチェックPCRへ本酵素を応用した例をご紹介いたします。
【方法】
弊社TAクローニングキット:TArget CloneTM [Code No. TAK-101]を用いて、pTA2 Vectorに4.5kbのPCRプロダクトをクローニングした後、コロニーダイレクトPCRを行って、インサートの有無を確認しました。(宿主大腸菌:JM109)
プライマー配列
(プライマーはベクター上に設計)
F primer:
TCGAGGTCGACGGTATCGAT
(20mer GC=55%)
R primer:
CGCTCTAGAACTAGTGGATC
(20mer GC=50%)
| 反応液組成 : | (μL) | サイクル条件 : | |||||
| D.W. | 21.9 | 94℃, 4min. | |||||
| 10×Buffer | 3 | ↓ | |||||
| 2mM dNTP | 3 | 94℃, 30sec. |  |
30 cycles | |||
| Forward primer (10pmole/μL) | 0.9 | 55℃, 30sec. | |||||
| Reverse primer (10pmole/μL) | 0.9 | 72℃, 4.5min. | |||||
| Blend Taq® | 0.3 | ||||||
 |
|||||||
| Total | 30 | ||||||
【結果】
PCR産物5μLを1%アガロースゲルで解析しました。4つのコロニーにおいていずれも良好な結果を得ることができ、3コロニーにインサートが挿入されていたことが確認できます。プライマーダイマーの生成はほとんど見られませんでした。
またデータは示しておりませんが、精製後のシーケンス結果も良好でした。
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