Can Get Signal 実施例6 マウス骨格筋のリン酸化Smadの検出(ウェスタンブロット)
【データご提供】
藤田保健衛生大学・総合医科学研究所・難病治療学研究部門
常陸 圭介 先生
◆実験1. 従来法との比較、及びブロッキング剤の選定
◆実験2. Can Get Signal®を用いた条件の至適化 [2次抗体濃度・ブロッキング時間の検討](追加検討)
【実験方法】
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1. サンプル
マウスの骨格筋のライセート
(実験1:100μg/Lane, 実験2:50μg/Lane)
2. タンパク質のウェスタンブロッティング
●ブロッティング方法:セミドライ法
●メンブレンのブロッキング
(1)ブロッキング溶液:5% Skim Milk in
TBST, 5% BSA in TBST, PVDF
Blocking Reagent for Can Get Signal®
(2) インキュベート温度:室温
(3) インキュベート時間:1時間 (or 4時間)
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3. 抗体の反応
<1次抗体>
(1) メーカー名 :Cell Signaling Technology
(2) 商品名 :rabbit anti-Phospho-
Smad3 (Ser433/435)
(3) 希釈倍率:1/1,000
(4) 希釈溶液:TBST or Can Get Signal®
Solution1
(5) インキュベート温度:4℃
(6) インキュベート時間:O/N
<2次抗体>
(1) メーカー名 :Cell Signaling Technology
(2) 商品名:Anti-rabbit IgG, HRP-linked
(3) 希釈倍率:1/10,000 or 1/30,000 or 1/50,000
(4) 希釈溶液:TBST or Can Get Signal®
Solution2
(5) インキュベート温度:室温
(6) インキュベート時間:1時間
4. シグナルの検出
PIERCE、SuperSignal West Femto
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【結果・コメント】
Can Get Signal®を使用した場合、どのブロッキング条件でも感度が大きく上昇しました。PVDF Blocking Reagentは今回の検討では5%スキムミルクと同 程度のブロッキング効果が見られました。以前からCan Get Signal®を使用していましたが従来の条件と比較したことが無かったため、今回改めてCan Get Signal®により検出感度が大きく上昇することが実感できました。
(追加検討後のコメント)
ブロッキング時間を延ばすことでバックグラウンドシグナルが若干減少しました。二次抗体濃度に関しては1/30000希釈にすることでバックグラウンドシグナルが減少し、S/N比の改善が認められました。
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