THUNDERBIRD 実施例4
尿細管細胞の上皮間葉転換の分子メカニズム解析

データご提供 : 名古屋大学大学院 創薬科学研究科 基盤創薬学専攻 細胞生化学研究室 辰川 英樹 様

<実験の目的>
 尿細管細胞のコラーゲン産生量の定量

<実験方法>

【サンプル】
  ヒト尿細管上皮細胞株由来cDNA

【遺伝子名】
  Collagen type I

【ターゲット長】
  83 bp

【反応液組成】
  THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix

  1 sample あたり、
  dH2O 2.6 μL
  10 mM F primer 0.2 μL
  10 mM R primer 0.2 μL
  THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix 5 μL
  cDNA 2 μL

  Total 10 μL

 

【サンプルの調製方法】
  Tissue Total RNA Mini Kit (FAVORGEN) でTotal RNA
  を精製し、ReverTra Ace®を用いて逆転写してcDNAを
  調製

【プライマー配列】
  Forward: CCTGCGTGTACCCCACTCA
  Reverse: ACCAGACATGCCTCTTGTCCTT

【PCRサイクル】
  95℃ 15 sec


 50 cycles
  55℃ 15 sec
  72℃ 30 sec
 
【測定機器】
  Illumina Eco
 

<結果・考察>

コラーゲン検出のためのプライマーを用いてスタンダードサンプルをPCRをした結果、融解曲線はシングルピークを示し、増幅曲線は定量性のある希釈系列の曲線を描くことができた。
THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mixを使用することで、コラーゲン産生の経時的な変化を確認することができた。

<感想・ご意見等>

操作が簡便であるにも関わらず、点線のthreshold の位置で非常に綺麗な希釈系列の曲線を描くことができた。実際の得れたデータも再現性が良く、大変満足いく結果が得られている。


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