大腸菌由来DNA合成酵素
T4 DNA Polymerase
TOYOBO
価格表
用途
●2本鎖DNA末端の平滑化
●プライマー伸長法によるmRNAの転写開始点の解析
●DNAフラグメントの3'端の標識
説明
dNTPs存在下で、3‘突出2本鎖DNAに本酵素を作用させた場合、平滑末端になった段階でExonuclease活性とPolymerase活性は競合状態となります。一方、dNTPs非存在下においては、Exonuclease活性によるDNAの分解反応が進みます。
原理
参考文献
1)A. Panet et al., Biochemistry, 12: 5045-5050(1973)
2)M. Goulian et al., J. Biol. Chem., 243: 627-638(1968)
3)I. R. Lehman, Methods in Enzymology, 29: 46-53(1974)
4)F. Sanger and A. R. Coulson, J. Mol. Biol., 94: 441(1975)
5)J. Sambrook et al., Molecular Cloning(A LaborartoryManual),108, Cold Spring Harbor Laboratory
6)R. M. Warlet and W. S.Reznikoff, Gene, 9: 307-319(1980)
7)N. Davidson et al., Gene, 42: 21-29(1986)
- 製品内容
T4 DNA Polymerase
10×Buffer[TPL-1R]
形状:
200mM KPO4(pH6.5)
2mM DTT
50% Glycerol
10×Buffer 〔Code No. TPL-1R〕組成:
500mM Tris-HCl (pH8.5)
70mM MgCl2
150mM (NH4)2SO4
5mM DTT
1mM EDTA
活性の定義:
Mung Bean Nucleaseにより部分消化した熱変性仔牛胸腺DNAを鋳型/プライマーとして、37℃、30分に10nmolesの全オリゴヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量を1Uとします。
起源:
E.coli B infected with T4 phage
純度:
本酵素10Uと1μgのsupercoiled φx174 DNAを、37℃で5時間反応させてもDNAの電気泳動パターンは変化しません。
- 基本反応条件
-
<5'末端の平滑化>
基質DNA 0.5～2μg
10×Buffer 2.5μL
2mM dNTPs 0.5μL
T4 DNA Polymerase 2U
Total Volume 25μL
37℃, 2hr.
基質DNA 0.2～0.5μg
10×Buffer 2μL
T4 DNA Polymerase 1U
Total Volume 20μL
37℃、Xmin.
反応時間は、削りたい長さによって設定します。30～80base/min.を目安とします。
↓
add: ラベルを含む2mM dNTPs 1μL
37℃, 1hr.
- ワンポイントアドバイス
●DNA合成反応について
本酵素は、DNAの高次構造の影響を受けやすいので、通常のDNA伸長反応にはKlenow Fragmentをお薦めします。
●2本鎖DNA末端の平滑化
本酵素によって、2本鎖DNAの平滑化を行う場合には、3‘→5’Exonuclease 活性による平滑化の場合においても、反応液にはdNTPs(最終濃度40～100μM)を加えてください。
●至適pHについて
本酵素の至適pHは8～9であり、pH7.5及びpH9.7では活性は約1/2となります。pHが8～9の範囲外のバッファーに溶解しているDNAサンプルを多く使用するときは、エタノール沈殿や精製キット(関連商品参照)等でバッファー置換を行うことをお勧めします。
- ※ 法規制について
- 毒： 毒物及び劇物取締法[医薬用外毒物]
- 国： 国民保護法[毒素]
- 劇： 毒物及び劇物取締法[医薬用外劇物]
- 組： カルタヘナ法(遺伝子組換え生物等の使用等の規制による
- 危： 消防法[危険物]
- 生物の多様性の確保に関する法律）
- Ｐ： PRTR法（化学物質排出把握管理促進法）[届け出義務物質]
- 申： ご購入時に申込書の提出が必要な製品
- 労： 労働安全衛生法[通知または表示義務物質]
- なし： 上記法令や申込書の提出に該当しない製品
