シングルセル・微量RNAに対応

NGS/リアルタイムPCR解析用 cDNA 調製キット GenNextRamDA-seqTM Single Cell Kit

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価格表

GenNextRamDA-seqTM Single Cell Kit

Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
RMD-101T 24回用 ¥118,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
RMD-101 96回用 ¥398,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し

NSR Primer

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
NSR Primer Set for human NSR-101 96回用 ¥24,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
NSR Primer Set for mouse NSR-102 96回用 ¥24,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し

RT-RamDATM cDNA Synthesis Kit

Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
RMD-201T 24回用 ¥59,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
RMD-201 96回用 ¥198,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し

用途

●シングルセル、微量RNAからのcDNA合成

説明

本キットは RT-RamDATM (Reverse Transcription with Random Displacement Amplification)法を採用した製品です。RT-RamDATM 法は逆転写酵素の鎖置換活性を利用した新規cDNA増幅方法であり、poly(A) RNAだけでなく、non-poly(A)由来のcDNAの高感度な検出が可能です。このためRT-RamDATM法では従来技術に比べ検出遺伝子が多いことが特徴です。


GenNext RamDA-seqTM Single Cell Kit (RMD-101, RMD-101T) はシングルセルや微量のRNAからNGS解析用のcDNA
を調製するためのキットです。本キットをご使用いただくこと
で完全長total RNA-seq用のcDNAを調製することが可能です。
(ライブラリー調製には、本製品の他、磁性ビーズ Agencourt AMPure XP試薬 (Beckman Coulter) およびライブラリー
調製試薬Nextera XT DNA Sample Preparation Kit (illumina)
が必要です。)
RT-RamDATM cDNA Synthesis Kit (RMD-201, RMD-201T)
はシングルセルや微量のRNAからリアルタイムPCR解析用のcDNAを調製するためのキットです。本キットで調製したcDNAは、高感度に遺伝子発現解析を行うことができます。

特長

●シングルセルや微量RNAに対応

1~100細胞または10pg~1ng total RNA からcDNAの調製が可能です。
 

●完全長cDNAの調製が可能

Oligo-dT primer のみを用いる従来法では困難であった10kb以上のターゲットRNAからcDNAの調製が可能であり、RNA全長からシーケンスリードが得られます。
 

●poly(A) RNAに加え、non-poly(A) RNAの検出が可能

Oligo-dT primer に加え、NSR(Not so random primer)を使用しており。従来法では検出できなかったnon-poly(A) RNAの検出も可能です。
 

●検出遺伝子数がアップ

ヒストンRNA、IncRNA、pre-mRNA、circRNAなどを含むさまざまなRNAの検出ができます。

原理

RamDA-seqTM(ラムダセック)は、理化学研究所 生命機能科学研究センター バイオインフォマティクス研究開発チームが開発した1細胞完全長トータルRNAシーケンス法「Random Displacement Amplification Sequencing」の略です。
既存の1細胞RNA解析法では、Oligo-dT primerのみを用いて逆転写するため、non-poly(A) RNAは合成できず、また途中でcDNA合成が止まった場合、全長の検出が困難でした。一方、RamDA-seqTM法では、random primerあるいはNSR primer*を使用するため、poly(A)配列以外からも合成が可能であり、non-poly(A) RNAを検出できます。また、これらprimerがRNAのさまざまな場所に結合しcDNA合成が開始されるため、RNA全長からシーケンスリードを得ることができます。
さらにRamDA-seqTM法は、cDNAが合成と同時に増幅されるため、従来法で実施している増幅用アダプター付加やPCRが必要なく、増幅によるバイアスを抑えることが可能です。

*NSR primerとは、Not so random primerの略で、18S, 28S RNA遺伝子に完全にマッチする配列を計算上除外したrandom primer のことです。random primer の代わりにNSR primerを用いることで、rRNAからのcDNA合成を抑制できます。

ヒト用、マウス用のNSR primerをご用意しております。ヒト由来のサンプルにはNSR Primer Set for human (NSR-101)を、マウス由来のサンプルにはNSR Primer Set for mouse(NSR-102)のご使用をお勧めします。



※RamDA-seqTMとRT-RamDATMは理化学研究所の商標です。

実施例

1. cDNA増幅率の検証

NIH3T3 total RNA 10pg から、従来の逆転写反応試薬およびRT-RamDATM cDNA Synthesis Kit にて、cDNA を調製し、リアルタイムPCR により各遺伝子を測定しました。
その結果、従来の逆転写反応試薬を使用した際のcDNA量に対して、RT-RamDATM cDNA Synthesis Kit では9 倍以上のcDNA を得ることができました。
 

2. インプットRNA量の検証

10pg と1ngのNIH3T3 total RNA を用いてRT-RamDATM cDNA Synthesis Kit にてcDNA を
調製し、リアルタイムPCR により8 遺伝子(N=3
で実施)のCt 値を比較しました。その結果、10pg
インプットと1ng インプットで高い相関が認められ、微量のインプット量からもcDNA 調製が可能
でした。


 

3. カバレッジの均一性の確認

mES total RNA 10pg から GenNext®RamDA-
seqTM Single Cell Kit にて、cDNA、二本鎖DNA
を調製し、次世代シーケンサー解析を行いました。
解析にはillumina MiSeq を使用しました。その
結果、調製したライブラリーがおおむね遺伝子
全体を均一にカバーしていることが確認できま
した。

 

実施例4:長鎖RNAにおけるcDNA調製の比較
実施例5:検出転写産物数の比較およびRNA種類別リード数の検証
実施例6:ランダムプライマーおよびNSR プライマー を用いた場合の rRNA混入率の比較

 

参考文献

Hayashi T. et al., Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9:619(2018)

製品内容
  RMD-101 RMD-101T
Lysis Buffer 480μL 120μL
Lysis Enhancer 108μL 27μL
RNase Inhibitor 22μL 5.5μL
Nuclease free water  
  960μL 240μL
RT-RamDATM Buffer
  240μL 60μL
RT-RamDATM Enzyme Mix
  54μL 13.5μL
RT-RamDATM Primer Mix
  54μL 13.5μL
gDNA Remover 54μL 13.5μL
2nd strand synthesis Buffer
 

330μL

82.5μL
2nd strand synthesis Enzyme
  55μL 13.75μL
2nd strand synthesis Primer Mix
  275μL 68.75μL

  RMD-201 RMD-201T
Lysis Buffer 480μL 120μL
Lysis Enhancer 108μL 27μL
RNase Inhibitor 22μL 5.5μL
Nuclease free water  
  960μL 240μL
RT-RamDATM Buffer
  240μL 60μL
RT-RamDATM Enzyme Mix
  54μL 13.5μL
RT-RamDATM Primer Mix
  54μL 13.5μL
gDNA Remover 54μL 13.5μL
備考

ライブラリー調製には、本製品の他、磁性ビーズ Agencourt AMPure XP試薬 (Beckman Coulter) およびライブラリー調製試薬Nextera XT DNA Sample Preparation Kit (illumina)
が必要です。

本キットには、NSR Primerは含まれておりません。ヒト由来のサンプルにはNSR Primer Set for human (NSR-101)を、マウス由来のサンプルにはNSR Primer Set for mouse(NSR-102)のご使用をお勧めします。

RamDA-seq実験の品質管理(QC)のための計算パイプラインRamDAQは、こちら

ワンポイントアドバイス

FAQはこちら →

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RamDA シリーズ用 Cell Lysis Kit

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
RamDA Cell Lysis Kit RMD-301 1,152回用 ¥12,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
※1 法規制について
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
: 消防法に基づく危険物です。
: 御購入時に申込書の提出が必要な製品です。
: 「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」 (カルタヘナ法)に基づく組換え体または昆虫細胞組換え体で生産されたタンパク質です。
該当なし: 上記法令や申込書の提出に該当しない製品です。