イルミナ社次世代シーケンサー用ライブラリー調製キット
GenNext® NGS Library Prep Kit
TOYOBO
価格表
用途
●イルミナ社次世代シーケンサー用ライブラリー調製
説明
GenNext® NGS Library Prep Kitは、断片化された2本鎖DNAやPCR産物からイルミナ社 次世代シーケンサー用ライブラリーを調製するためのキットです。本製品をご使用いただくことで簡便かつ迅速にライブラリーを調製することができます。
本製品では、1ng - 1μg の2本鎖DNA断片の末端修復および3’末端のアデニル化を行った後、Tオーバーハングのアダプターをライゲーションします。
インプットするDNA量が少なく、ライブラリーの増幅が必要な場合は、遺伝子改変型KOD DNA polymeraseを用いて開発された高正確性PCR用酵素を用いて、末端にアダプター配列をもつライブラリーを低バイアスで増幅します。
特長
●簡便かつ迅速な操作フロー
末端修復および3’末端のアデニル化からアダプターライゲーションまでの工程を同一容器内で行うことができます。末端修復および3’末端のアデニル化は15分、アダプターのライゲーションは15分で実施可能です。ライブラリー増幅はアニーリング10秒、伸長15秒のサイクルで実施できます。
●広範囲のインプット量
広範囲のインプット量(1ng - 1μg)に対応するように設計されています。
●低バイアスのライブラリー増幅
ライブラリーの増幅に使用するLibrary Amplification Master Mixには遺伝子改変型KOD DNA polymeraseを用いて開発された高正確性PCR用酵素が使用されています。GCの偏りによる増幅への影響を最小限に抑えており、さまざまな領域を均一に増幅することが可能です。
実施例
1.NGSを用いたライブラリー調製キットの評価
MiSeq® (イルミナ社)およびMiSeq® Reagent Kit v2(300 Cycles)(イルミナ社)を用いて大腸菌ゲノム(1μg PCR Freeあるいは1ng 12サイクル増幅)の次世代シーケンサー解析を実施しました。ライブラリーの調製は、GenNext® NGS Library Prep Kit あるいはA社 ライブラリー調製キットを用いて実施しました。
ライブラリーデータはリード数を等しくするためダウンサンプリングを行い、各サンプル100万リードに揃えて解析しました。解析はCLC Genomics Workbench (キアゲン社社/CLC bio)を用いました。
その結果、GenNext®NGS Library Prep Kitでは、A社の試薬と比較して良好なマッピング率、リファレンスとの一致率を示しました。
2.ライブラリー収量および分布の比較
断片化処理済みのヒトゲノムDNA 1, 10, 100ng、大腸菌ゲノムDNA 1μg、あるいは100bp DNAラダー 1, 10ngから GenNext® NGS Library Prep KitあるいはA社ライブラリー調製キットでライブラリーを調製しました。
アダプターはイルミナ社のインデックスアダプター、ライブラリーのクリーンアップはAgencourt AMPure XP試薬(Beckman Coulter)を用いました。
1μgは増幅なし、1ngは11サイクル、10ngは8サイクル、100ngは5サイクルで増幅し、ライブラリーサイズの分布をMultiNA®(島津製作所)で確認しました。ライブラリー収量はGenNext® NGS Library Quantification Kit [Code: NLQ-101]で確認しました。
その結果、ライブラリーサイズの分布はGenNext® NGS Library Prep KitとA社の試薬で同等であり、低インプット量において、GenNext® NGS Library Prep Kitでは、A社の試薬と比較して高い収量を示しました。いずれもMiSeq® に供するために必要な4nM以上の収量が得られました。
- 製品内容
【LPK-101T】 End Repair and A-tailing Buffer 80μL×1本 End Repair and A-tailing Enzyme 20μL×1本 Ligation Solution 400μL×1本 Library Amplification Master Mix 230μL×1本 Library Amplification Primer Mix 46μL×1本
【LPK-101】 End Repair and A-tailing Buffer 240μL×1本 End Repair and A-tailing Enzyme 60μL×1本 Ligation Solution 1,200μL×1本 Library Amplification Master Mix 690μL×1本 Library Amplification Primer Mix 138μL×1本
【LPK-101L】 End Repair and A-tailing Buffer 960μL×1本 End Repair and A-tailing Enzyme 240μL×1本 Ligation Solution 1,600μL×3本 Library Amplification Master Mix 1,380μL×2本 Library Aplification Primer Mix 552μL×1本
※アダプターと磁性ビーズ(アダプターのライゲーションおよびライブラリー増幅後の精製用)は含まれておりません。
アダプター
インデックスを有するIllumina® TruSeq® などのライブラリー作製で一般的に使用されるアダプターが使用できます。
(例)
IDT for Illumina® – TruSeq® DNA UD Indexes v2 (96 Indexes, 96 Samples)
カタログ番号:20040870
(上記以外も、同様の設計を有するアダプターであれば本キットで使用できます。)
SPRI(solid phase paramagnetic bead)磁性ビーズ
Agencourt AMPure XP試薬(Beckman Coulter) カタログ番号:A63880, A63881等を推奨いたします。ご使用にあたっては試薬の取扱説明書に従ってください。
- 基本反応条件
断片化DNA
↓
末端修復および3'末端のアデニル化
↓
アダプターのライゲーション
↓
ライゲーション後の精製
↓
(DNA量が少ない場合)
ライブラリー増幅
↓
ライブラリー増幅後の精製
↓
(オプション)
サイズセレクション
- ワンポイントアドバイス
トラブルシューティングは
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- ※ 法規制について
- 毒： 毒物及び劇物取締法[医薬用外毒物]
- 国： 国民保護法[毒素]
- 劇： 毒物及び劇物取締法[医薬用外劇物]
- 組： カルタヘナ法(遺伝子組換え生物等の使用等の規制による
- 危： 消防法[危険物]
- 生物の多様性の確保に関する法律）
- Ｐ： PRTR法（化学物質排出把握管理促進法）[届け出義務物質]
- 申： ご購入時に申込書の提出が必要な製品
- 労： 労働安全衛生法[通知または表示義務物質]
- なし： 上記法令や申込書の提出に該当しない製品
