●リアルタイムRT-PCR

本キットは、逆転写酵素として高効率逆転写酵素ReverTra Ace^® と PCR 酵素としてTth DNA Polymerase を用いた2 酵素系によるワンステップリアルタイムRT-PCR 用キットです。主にTaqMan^® アッセイ法を用いるリアルタイムPCR に用いることができます。

逆転写反応とPCR とを同一の反応系で連続的に行うため、反応液の分注操作が1 回で済み、ハイスループット化に適しています。
また、サンプル間のクロスコンタミネーションの危険性も低減します。



本製品は、2 種類の酵素と最適化されたバッファー組成を組み合わせることで、微量なRNA を迅速に定量することを可能にしました。
RNA ウイルスや発現量の少ないmRNA の定量に有利です。また、ターゲットの配列の影響を受けにくく、さまざまなRNA を高感度に検出することが可能です。

● 迅速・高感度
TaqMan^® probe を用いるワンステップリアルタイムRT-PCR 法により、微量なRNA を迅速・高感度に検出することができます。

●配列バイアスの低減
ターゲットの配列に左右されることなく、様々なRNA を高感度に検出が可能です。
多色検出(Multiplex)での各ターゲットの増幅の偏りも最小限に抑えます。

●夾雑物耐性の向上
ヘマチンなどのPCR 阻害活性を示す夾雑物の影響を回避することができます。

●dUTP を使用
Uracil-N-glycosylase (UNG) を添加することで、キャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性を防止することができます。
* 本キットにUNG は含まれません。


●様々な危機に対応
【対応可能機器例】

機　器	ROX 最終濃度 (添加量)
Applied Biosystems 7000、7300、7700、7900HT、StepOne™、  StepOnePlus™	1× (1/50量)
Applied Biosystems 7500、7500Fast、 ViiA™、QuantaStudio、Agilent  Technologies Mx3000P、Mx3005P、Mx4000	0.1× (1/500量)
Roche Diagnostics LightCycler® 2.0、LightCycler® Nano、 Bio-Rad  MiniOpticon™、CFX96 Touch™、 BioFlux Line Gene	不要

1.エンテロウイルスRNA の高感度検出

エンテロウィルスRNA を4 倍希釈し、TaqMan^® probe 法を用いて検出感度・定量性を他社製品と比較しました。

プライマー・ TaqMan^® probe は論文記載のものを(最適化することなく) そのまま使用しました。
解析にはApplied Biosystems^® StepOnePlus^™を用いました。

本試薬でのみ10 コピー以下のRNA を検出することが可能であり、幅広いダイナミックレンジでの定量を行うことができました。本キットは、RNA ウイルスや発現量の少ないmRNA の検出・定量に有効です。
 

2. 様々なウイルスの検出感度の比較

11 種類のウイルスRNA の4 倍希釈系列を作成し、TaqMan^® probe 法を用いて最高検出感度の比較を行いました。

プライマー・ TaqMan^® probe は論文記載のものをそのまま使用しました。
解析にはApplied Biosystems^® StepOnePlus^™を用いました。

グラフは、検出された最も低いコピー数を各試薬ごとにプロットしたものです。

その結果、本キットでのみ、全てのターゲットを30 コピー以下の感度で検出・定量が可能があることが分かりました。
この実験から、本試薬ではターゲットの配列に左右されず、様々なRNA を高感度に検出することが可能であることが示されました。
 

3.多色検出(Multiplex) 系での発現定量

3 種類の蛍光色素で標識したTaqMan^® probe を用い、単独検出と、3 種類のTaqMan^® probe を一度に用いるMultiplex 検出系にて、IL-β、TNF-α、GAPDH 遺伝子の発現量を解析しました。
実験にはHeLa S3 RNA (1pg ～ 100ng の10 倍希釈[6 段階]) をサンプルとして用い、Roche Diagnositics 社LightCycler^® 96 にて解析を行いました。
その結果、各遺伝子を単独(Singleplex) (図1) および3 チャンネルを用いた Multiplex 検出(図2) において同等な感度で検出可能であり、PCR 効率と相関係数に大きな差は認められないことが分かりました(表1)。


 

4.臨床検体を用いたRS ウイルスA型、及びB 型の同時定量

20 検体の咽頭ぬぐい液から抽出したRNA サンプルを用いて、RT-PCR 法、及びTHUNDERBIRD^® One-step qRT-PCR Kit によるqRT-PCR 法によるRS ウイルスの検出を行いました。
また、並行して抗体検査を用いて解析を行い比較を行いました。
qRT-PCR は、RS ウイルスのA 型とB 型を判別できるように、特異的なプライマーとそれぞれ異なる色素で標識したTaqMan^® probe を用いて定量を行いました。
解析には、Roche Diagnositics 社LightCycler^® 96 を用いました。その結果、抗体検査法で偽陰性と判定された検体についても、PCR法と高い相関で感染の有無を判定可能でした。また、型判別の結果も完全に一致していました。