東洋紡ライフサイエンス事業部 / 高効率One-step qRT-PCR Kit THUNDERBIRD<SUP>®</SUP> Probe One-step qRT-PCR Kit

RNA ウイルスなどの迅速・高感度定量に最適です。

高効率One-step qRT-PCR Kit THUNDERBIRD^® Probe One-step qRT-PCR Kit

TOYOBO

価格表

Code No.	包装	価格	保存温度	取扱説明書データシート	SDS	法規制^※1
QRZ-101	100回用	￥33,000	-20℃			該当無し

用途

●リアルタイムRT-PCR

説明

本キットは、逆転写酵素として高効率逆転写酵素ReverTra Ace^® と PCR 酵素としてTth DNA Polymerase を用いた2 酵素系によるワンステップリアルタイムRT-PCR 用キットです。主にTaqMan^® アッセイ法を用いるリアルタイムPCR に用いることができます。

逆転写反応とPCR とを同一の反応系で連続的に行うため、反応液の分注操作が1 回で済み、ハイスループット化に適しています。
また、サンプル間のクロスコンタミネーションの危険性も低減します。

本製品は、2 種類の酵素と最適化されたバッファー組成を組み合わせることで、微量なRNA を迅速に定量することを可能にしました。
RNA ウイルスや発現量の少ないmRNA の定量に有利です。また、ターゲットの配列の影響を受けにくく、さまざまなRNA を高感度に検出することが可能です。

特長

● 迅速・高感度
TaqMan^® probe を用いるワンステップリアルタイムRT-PCR 法により、微量なRNA を迅速・高感度に検出することができます。

●配列バイアスの低減
ターゲットの配列に左右されることなく、様々なRNA を高感度に検出が可能です。
多色検出(Multiplex)での各ターゲットの増幅の偏りも最小限に抑えます。

●夾雑物耐性の向上
ヘマチンなどのPCR 阻害活性を示す夾雑物の影響を回避することができます。

●dUTP を使用
Uracil-N-glycosylase (UNG) を添加することで、キャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性を防止することができます。
* 本キットにUNG は含まれません。

●様々な危機に対応
【対応可能機器例】

機　器	ROX 最終濃度 (添加量)
Applied Biosystems 7000、7300、7700、7900HT、StepOne™、 StepOnePlus™	1× (1/50量)
Applied Biosystems 7500、7500Fast、 ViiA™、QuantaStudio、Agilent Technologies Mx3000P、Mx3005P、Mx4000	0.1× (1/500量)
Roche Diagnostics LightCycler^® 2.0、LightCycler^® Nano、 Bio-Rad MiniOpticon™、CFX96 Touch™、 BioFlux Line Gene	不要

実施例

1.エンテロウイルスRNA の高感度検出

エンテロウィルスRNA を4 倍希釈し、TaqMan^® probe 法を用いて検出感度・定量性を他社製品と比較しました。

プライマー・ TaqMan^® probe は論文記載のものを(最適化することなく) そのまま使用しました。
解析にはApplied Biosystems^® StepOnePlus^™を用いました。

本試薬でのみ10 コピー以下のRNA を検出することが可能であり、幅広いダイナミックレンジでの定量を行うことができました。本キットは、RNA ウイルスや発現量の少ないmRNA の検出・定量に有効です。

2. 様々なウイルスの検出感度の比較

11 種類のウイルスRNA の4 倍希釈系列を作成し、TaqMan^® probe 法を用いて最高検出感度の比較を行いました。

プライマー・ TaqMan^® probe は論文記載のものをそのまま使用しました。
解析にはApplied Biosystems^® StepOnePlus^™を用いました。

グラフは、検出された最も低いコピー数を各試薬ごとにプロットしたものです。

その結果、本キットでのみ、全てのターゲットを30 コピー以下の感度で検出・定量が可能があることが分かりました。
この実験から、本試薬ではターゲットの配列に左右されず、様々なRNA を高感度に検出することが可能であることが示されました。

3.多色検出(Multiplex) 系での発現定量

3 種類の蛍光色素で標識したTaqMan^® probe を用い、単独検出と、3 種類のTaqMan^® probe を一度に用いるMultiplex 検出系にて、IL-β、TNF-α、GAPDH 遺伝子の発現量を解析しました。
実験にはHeLa S3 RNA (1pg ～ 100ng の10 倍希釈[6 段階]) をサンプルとして用い、Roche Diagnositics 社LightCycler^® 96 にて解析を行いました。
その結果、各遺伝子を単独(Singleplex) (図1) および3 チャンネルを用いた Multiplex 検出(図2) において同等な感度で検出可能であり、PCR 効率と相関係数に大きな差は認められないことが分かりました(表1)。

4.臨床検体を用いたRS ウイルスA型、及びB 型の同時定量

20 検体の咽頭ぬぐい液から抽出したRNA サンプルを用いて、RT-PCR 法、及びTHUNDERBIRD^® One-step qRT-PCR Kit によるqRT-PCR 法によるRS ウイルスの検出を行いました。
また、並行して抗体検査を用いて解析を行い比較を行いました。
qRT-PCR は、RS ウイルスのA 型とB 型を判別できるように、特異的なプライマーとそれぞれ異なる色素で標識したTaqMan^® probe を用いて定量を行いました。
解析には、Roche Diagnositics 社LightCycler^® 96 を用いました。その結果、抗体検査法で偽陰性と判定された検体についても、PCR法と高い相関で感染の有無を判定可能でした。また、型判別の結果も完全に一致していました。

製品内容

2xReaction Buffer 　　1.25mL×2本
DNA Polymerase　　　 125μL×1本
RT Enzyme Mix 　　　　 125μL×1本
50xRox Reference dye^* 100μL×1本
RNase free water 1.25mL×2本
(50μl反応で100回用となります)
* ROX 溶液が別添付となっており、ほとんどのリアルタイムPCR 測定機器に対応可能です。

一部の取扱説明書(p.6, (b)TaqMan^®
Probe)にTm値の計算時のプライマー
・プローブ濃度が50μMと記載されて
いますが、正しくは0.5μMです。
訂正してお詫び申し上げます。

基本反応条件: RNase free water      XμL
2×Reaction Buffer 25μL
DNA Polymerase 1.25μL
RT Enzyme Mix    1.25μL
Forward Primer 25pmol
Reverse Primer 25pmol
TaqMan^® probe 10pmol
50×ROX Reference dye^*1 1/0.1μL
(Uracil-N-Glycosylase 1unit^*2)
RNA溶液 YμL
Total Volume 50μL

*1 50X ROX reference dyeは、Applied Biosystems^®社製機器など、ウェル間の蛍光強度および分注誤差補正のためにパッシブリファレンスを用いる機器での反応の際に添加してください。また、補正を行わない機器では添加する必要はありません。

*2 Uracil-N-Glycosylase(UNG)処理を実施する場合は、熱感受性(heat-labile)UNGをご使用ください。各社の推奨条件に従って、酵素量を調整することができます。

Cycle
(20～25℃, 10min.^*3)
     ↓
50℃, 10min.
     ↓
95℃, 1min.
     ↓
95℃, 15sec.
60℃, 45sec.　40～45 cycles

*3 UNG処理を行う場合は、逆転写反応の前に、UNG反応のステップを設定してください。上記には一般的な温度条件および反応時間を示しましたが、各社の推奨条件に従って調整してください。

ワンポイントアドバイス: トラブルシューティングは
←こちら

品名	Code No.	包装	価格	保存温度	取扱説明書データシート	SDS	法規制^※1
MagExtractor -Viral RNA-	NPK-401F	100回用	￥32,000	4℃			該当無し
MagExtractor -RNA-	NPK-201F	100回用	￥27,000	4℃			該当無し
Magical Trapper	MGS-101	1個	￥38,000	室温	ー	ー	該当無し

高効率One-step qRT-PCR Kit THUNDERBIRD^® Probe One-step qRT-PCR Kit

価格表

用途

説明

特長