RNA ウイルスなどの迅速・高感度定量に最適です。
高効率One-step qRT-PCR Kit THUNDERBIRD® Probe One-step qRT-PCR Kit
価格表
| Code No. | 包装 | 価格 | 保存温度 | 取扱説明書 データシート |
SDS | 法規制※1 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| QRZ-101 | 100回用 | ￥33,000 | -20℃ |
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|
該当無し |
用途
●リアルタイムRT-PCR
説明
-
本キットは、逆転写酵素として高効率逆転写酵素ReverTra Ace® と PCR 酵素としてTth DNA Polymerase を用いた2 酵素系によるワンステップリアルタイムRT-PCR 用キットです。主にTaqMan® アッセイ法を用いるリアルタイムPCR に用いることができます。
逆転写反応とPCR とを同一の反応系で連続的に行うため、反応液の分注操作が1 回で済み、ハイスループット化に適しています。
また、サンプル間のクロスコンタミネーションの危険性も低減します。
本製品は、2 種類の酵素と最適化されたバッファー組成を組み合わせることで、微量なRNA を迅速に定量することを可能にしました。
RNA ウイルスや発現量の少ないmRNA の定量に有利です。また、ターゲットの配列の影響を受けにくく、さまざまなRNA を高感度に検出することが可能です。
特長
● 迅速・高感度
TaqMan® probe を用いるワンステップリアルタイムRT-PCR 法により、微量なRNA を迅速・高感度に検出することができます。
●配列バイアスの低減
ターゲットの配列に左右されることなく、様々なRNA を高感度に検出が可能です。
多色検出(Multiplex)での各ターゲットの増幅の偏りも最小限に抑えます。
●夾雑物耐性の向上
ヘマチンなどのPCR 阻害活性を示す夾雑物の影響を回避することができます。
●dUTP を使用
Uracil-N-glycosylase (UNG) を添加することで、キャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性を防止することができます。
* 本キットにUNG は含まれません。
実施例
1.エンテロウイルスRNA の高感度検出
エンテロウィルスRNA を4 倍希釈し、TaqMan® probe 法を用いて検出感度・定量性を他社製品と比較しました。プライマー・ TaqMan® probe は論文記載のものを(最適化することなく) そのまま使用しました。
解析にはApplied Biosystems® StepOnePlus™を用いました。
本試薬でのみ10 コピー以下のRNA を検出することが可能であり、幅広いダイナミックレンジでの定量を行うことができました。
本キットは、RNA ウイルスや発現量の少ないmRNA の検出・定量に有効です。
2. 様々なウイルスの検出感度の比較
11 種類のウイルスRNA の4 倍希釈系列を作成し、TaqMan® probe 法を用いて最高検出感度の比較を行いました。
プライマー・ TaqMan® probe は論文記載のものをそのまま使用しました。
解析にはApplied Biosystems® StepOnePlus™を用いました。
グラフは、検出された最も低いコピー数を各試薬ごとにプロットしたものです。
その結果、本キットでのみ、全てのターゲットを30 コピー以下の感度で検出・定量が可能があることが分かりました。
この実験から、本試薬ではターゲットの配列に左右されず、様々なRNA を高感度に検出することが可能であることが示されました。
3.多色検出(Multiplex) 系での発現定量
3 種類の蛍光色素で標識したTaqMan® probe を用い、単独検出と、3 種類のTaqMan® probe を一度に用いるMultiplex 検出系にて、IL-β、TNF-α、GAPDH 遺伝子の発現量を解析しました。
実験にはHeLa S3 RNA (1pg ～ 100ng の10 倍希釈[6 段階]) をサンプルとして用い、Roche Diagnositics 社LightCycler® 96 にて解析を行いました。
その結果、各遺伝子を単独(Singleplex) (図1) および3 チャンネルを用いた Multiplex 検出(図2) において同等な感度で検出可能であり、PCR 効率と相関係数に大きな差は認められないことが分かりました(表1)。
4.臨床検体を用いたRS ウイルスA型、及びB 型の同時定量
20 検体の咽頭ぬぐい液から抽出したRNA サンプルを用いて、RT-PCR 法、及びTHUNDERBIRD® One-step qRT-PCR Kit によるqRT-PCR 法によるRS ウイルスの検出を行いました。
また、並行して抗体検査を用いて解析を行い比較を行いました。
qRT-PCR は、RS ウイルスのA 型とB 型を判別できるように、特異的なプライマーとそれぞれ異なる色素で標識したTaqMan® probe を用いて定量を行いました。
解析には、Roche Diagnositics 社LightCycler® 96 を用いました。その結果、抗体検査法で偽陰性と判定された検体についても、PCR法と高い相関で感染の有無を判定可能でした。また、型判別の結果も完全に一致していました。
- 製品内容
-
2xReaction Buffer
DNA Polymerase
RT Enzyme Mix
50xRox Reference dye*
RNase free water
(50μl反応で100回用となります)
* ROX 溶液が別添付となっており、ほとんどのリアルタイムPCR 測定機器に対応可能です。
一部の取扱説明書(p.6, (b)TaqMan®
Probe)にTm値の計算時のプライマー
・プローブ濃度が50μMと記載されて
いますが、正しくは0.5μMです。
訂正してお詫び申し上げます。
- 基本反応条件
-
RNase free water Xμl
2×Reaction Buffer 25μl
DNA Polymerase 1.25μl
RT Enzyme Mix 1.25μl
Forward Primer 25pmol
Reverse Primer 25pmol
TaqMan® probe 10pmol
50×ROX Reference dye*1 1/0.1μl
(Uracil-N-Glycosylase 1unit*2)
RNA溶液 Yμl
Total Volume 50μl
*1 50X ROX reference dyeは、Applied Biosystems®社製機器など、ウェル間の蛍光強度および分注誤差補正のためにパッシブリファレンスを用いる機器での反応の際に添加してください。また、補正を行わない機器では添加する必要はありません。
*2 Uracil-N-Glycosylase(UNG)処理を実施する場合は、熱感受性(heat-labile)UNGをご使用ください。各社の推奨条件に従って、酵素量を調整することができます。
Cycle
(20～25℃, 10min.*3)
↓
50℃, 10min.
↓
95℃, 1min.
↓
95℃, 15sec.
60℃, 45sec. 40～45 cycles
*3 UNG処理を行う場合は、逆転写反応の前に、UNG反応のステップを設定してください。上記には一般的な温度条件および反応時間を示しましたが、各社の推奨条件に従って調整してください。
- ワンポイントアドバイス
-
キャリーオーバーによる偽陽性の防止
関連商品
●RNA調製関連試薬・器具
| 品名 | Code No. | 包装 | 価格 | 保存温度 | 取扱説明書 データシート |
SDS | 法規制※1 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MagExtractor -Viral RNA- | NPK-401F | 100回用 | ￥32,000 | 4℃ |
|
|
該当無し |
| MagExtractor -RNA- | NPK-201F | 100回用 | ￥27,000 | 4℃ |
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該当無し |
| Magical Trapper | MGS-101 | 1個 | ￥38,000 | 室温 | ー | ー | 該当無し |
- ※1 法規制について
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毒： 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
劇： 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
危： 消防法に基づく危険物です。
申： 御購入時に申込書の提出が必要な製品です。
組： 「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」 (カルタヘナ法)に基づく組換え体または昆虫細胞組換え体で生産されたタンパク質です。
該当なし： 上記法令や申込書の提出に該当しない製品です。
