DNA断片やニックを連結する活性を有する酵素です。

T4ファージ由来DNA連結酵素 T4 DNA Ligase

価格表

Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
LGA-111 400U×1本 ¥15,000 -20℃ データシート 該当無し
LGA-111X5 (400U×1本)×5 ¥60,000 -20℃ データシート 該当無し

用途

●DNA断片やニックの連結

目的遺伝子のベクターへの挿入や、DNAへのリンカー付加などの反応に用いることができます。
 

説明

T4 DNA Ligaseは、隣接したDNAの5'端のリン酸基と3'端の水酸基をホスホジエステル結合によって連結する酵素で、Mg2+とrATPを要求します。
平滑末端及び突出末端の2本鎖DNA、またはニックの入った2本鎖DNAに作用しますが、RNAとRNAや、RNAとDNAにはほとんど作用しません。
また、ライゲーション反応の速度は、DNA末端の形状及び塩基配列によって異なります。

特長

実施例

DNA末端形状による反応性の比較

<b>DNA末端形状による反応性の比較</b>

様々な制限酵素により切断したDNA断片を用いDNAの末端形状によるT4 DNA Ligaseの反応性の違いを検討しました。
5'末端濃度を0.1μMとし、様々な酵素量で16℃で1hr.反応させた後、電気泳動解析した結果をAに示しました。また同様に、5'末端濃度を0.1μM(HaeⅢは1.0μM)とし、16℃で様々な時間反応させた後、電気泳動解析した結果をBに示しました。
結果より、平滑末端のDNAは、突出末端のDNAに比べて、ライゲーション効率が低いことが分かります。T4 DNA Ligaseの平滑末端DNAに対するKm値は突出末端の場合に比べ約100倍高いため、平滑末端DNAのLigation反応では、DNAの濃度とLigaseの酵素量を高く設定する必要があります。

参考文献

1)N. E. Murray et al., J. Mol. Biol.,132: 493(1979)
2)B. Weiss et al., J. Biol. Chem.,243: 4543(1968)

製品内容

T4 DNA Ligase(1-5U/μl)
10×Buffer* [LGA-1B]
*rATPは含まれません。rATP[Code No.ATP-111]を用いることができます。
 

形状:
20mM Tris-HCl (pH7.6)
1mM EDTA
60mM KCl
5mM DTT
50% Glycerol

10×Buffer [Code No. LGA-1B] 組成:
  660mM Tris-HCl (pH7.6)
  100mM DTT
    66mM MgCl2

活性の定義:
ATP-PPi交換反応において37℃,pH7.6で20分に1nmoleの32PPiを交換する酵素量を1Uとします。
本酵素1U(Weiss Unit)は、125Ligation Unitに相当します。

起源:
E.coli 組換体

純度:
本酵素10Uと1μgのλDNA/HindⅢ分解物とを、16℃で20時間反応させてもDNAの電気泳動パターンは変化しません。
本酵素10Uと1μgのsuper coiled φx174 DNA とを、16℃で20時間反応させてもDNAの電気泳動パターンは変化しません。
活性測定条件において、本酵素と1μgのE.coli [3H]-DNAとの反応で酸可溶性画分に遊離される放射活性は1時間に1U当たり0.01%以下です。
活性測定条件において、本酵素と1μgの5‘端に32PをラベルしたλDNA/HindⅢ分解物との反応で酸可溶性画分に遊離される放射活性は1時間に1U当たり
0.01%以下です。
 

基本反応条件

<ベクターへのライゲーション>
滅菌蒸留水 Xμl
ベクターDNA 0.05-0.5μg
インサートDNA ベクターの3倍のmole数
10×Buffer 2μl
rATP 1mM
T4 DNA Ligase 0.5-1U(突出末端)
1-5U(平滑末端)
Total Volume 20μl

16℃、4-16hr.

<リンカーライゲーション>
滅菌蒸留水 Xμl
DNA 0.1-1μg
リンカー DNAの10倍のmole数
10×Buffer 2μl
rATP 1mM
T4 DNA Ligase 1-5U
Total Volume 20μl

16℃、8-16hr.

*DNAの濃度や形状、塩基配列、長さによって効率は変化します。
 

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ワンポイントアドバイス

●平滑末端のライゲーション
平滑末端のライゲーションは、突出末端に比べて反応性が低い傾向にあります(Km値は、突出末端の約100倍)。平滑末端によるライゲーションを行う場合は、DNA濃度を高くし、使用する酵素量を突出末端の2~5倍程度多く添加します。


●反応温度について
本酵素の至適温度は37℃ですが、連結するDNAの末端のハイブリダイゼーションの効率を考えて通常反応は16℃で行います。場合により、4℃~室温で反応することも可能です。


●EDTAについて
本酵素はMg2+を要求するため、Mg2+をキレートするEDTAは反応を阻害する場合があります。高濃度のEDTAを含むバッファーにDNAを溶解させたサンプルとして使用する場合には、滅菌蒸留水かTEバッファーに置換した後、使用することをお勧めします。


●DNA量について
プラスミドDNAとインサートDNAの反応は、モル比で1:3になるようにします。コスミドやファージへのライゲーションの場合は、ベクターとインサートのモル比は1:1になるようにして、DNA濃度も高く設定します(0.05~0.1μg/μl以上)。

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※1 法規制について
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
: 消防法に基づく危険物です。
: 御購入時に申込書の提出が必要な製品です。
: 「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」 (カルタヘナ法)に基づく組換え体または昆虫細胞組換え体で生産されたタンパク質です。
該当なし: 上記法令や申込書の提出に該当しない製品です。