クルードサンプル、増幅困難な配列おまかせください!

高成功率PCR酵素 KOD FX

価格表

Code No. 包装 価格 キャンペーン価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
KFX-101 200U×1本(200回用) ¥35,000 ¥21,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
KFX-101X5 (200U×1本)×5 ¥140,000 ¥98,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
KFX-101X10 (200U×1本)×10 ¥260,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し

用途

● PCR

説明

本製品は、KOD DNA polymeraseをベースに開発された高性能PCR試薬です。
優れた「増幅成功率」、「伸長性」、「増幅効率」を示し、幅広いPCRにおいて確実な結果が期待できます。
PCR成功率が高く、あらゆる実験における検討に適したPCR酵素です。
KOD FXのPCRエラーによるミス塩基の取り込み頻度(エラー率)は、実際にシーケンシングにて解析した結果、144,535塩基中、わずか19塩基でした(Taq DNA polymeraseの約11倍の正確性)。よって、正確性はKOD -Plus-やKOD -Plus-Ver.2より若干下がりますが、クローニングにも充分応用可能です。この酵素で増幅されたDNA断片の末端のほとんどは、平滑化されています。


 

特長

●高い増幅成功率
GC-richターゲットや細胞懸濁液・マウステール/植物ライセート・全血・カビ・酵母などのクルードサンプルなどからも高い成功率で増幅が可能です。

●抜群の増幅効率
高い収量が得られるため、少ない鋳型量からでも増幅が可能です。

●優れた伸長性
λDNAから40kb、humanゲノムDNAから24kb、cDNAから13.5kbの増幅が可能であることを確かめています。

●ホットスタートでPCRパフォーマンス向上
2種類の抗KOD抗体を酵素に混合することによって、非特異反応の原因となる常温下でのPolymerase活性と3'→5'Exonuclease活性を抑制しています。抗体はPCRの最初の変性ステップで失活し、増幅反応には影響を及ぼしません。
 


 

実施例

1.アルカリ溶解法で調製したマウステールライセートからの増幅例

アルカリ溶解法(右の基本反応条件御参照)で調製したマウステールライセート0.5μlを直接PCR反応液に添加して、Mouse membrane glycoprotein(Thy-1)gene(M10246)をターゲットとして、2ステップサイクルを用いて、30サイクルの増幅を行いました。
その結果、KOD FXを用いた場合のみ、明瞭な増幅が認められました。アルカリ溶解法は、Proteinase Kを用いる方法よりも手間が少ないため、より簡便にトランスジェニックマウスの遺伝子解析ができるものと思われます。
また、増幅産物を精製なしで、数種類の制限酵素で消化する検討もあわせて行い、下記制限酵素により完全に切断を受けることを確認しました。



 

2. ワンステップ法で調製した植物ライセートからの増幅例

ワンステップ法(右の基本反応条件御参照)で調製したトマト、タバコ、イネの葉、及び精米のライセート1μlを直接PCR反応液に添加して、rbcLをターゲットとして、2ステップサイクルを用いて、30サイクルの増幅を行いました。
その結果、KOD FXを用いたときのみ明瞭な増幅が認められました。ワンステップ法とKODFXを組み合わせることで、植物の遺伝子解析を簡便化できると思われます。



 

3.鋳型DNA量の検討

KOD FXと他社PCR酵素を用いて、鋳型DNA量と増幅効率の比較を行いました。
増幅反応は、0.1ng~100ngまでのゲノムDNAを鋳型に、human β-globin 2.8kbをターゲットとして、50μlの反応系で、プライマー15pmoles、KOD FX 1Uを用いて、2ステップサイクルにて30サイクルの増幅を行いました。
その結果、KOD FXでは、他社PCR酵素に比べて明らかに増幅効率が高い結果を得ることができました。


 

※その他の実施例


 実施例4: Long PCRにおけるPrimerの精製グレード及び鎖長の影響
 実施例5: Long Target(〜40Kb)の増幅例
 実施例6: 真核細胞最長DMD遺伝子(13.5Kb)のPCRクローニングに挑戦
 実施例7: 少ない鋳型量(0.1ng~100ng)からの増幅例
 実施例8: プライマー設計に制限がある場合の増幅例
 実施例9: GC richターゲットの増幅
 実施例10: マウステールLysateからの増幅例
 実施例11: 血液(Whole Blood)サンプルからの増副例
 実施例12: 培養細胞からの増幅例 細胞懸濁液を直接サンプルとして使用
 実施例13: 植物サンプル(葉・米粒)からのPCR増幅例
 実施例14: マウステール溶解液を直接用いたトランスジェニックマウスのジェノタイピング
 実施例15: トランスジェニックマウステールからのジェノタイピング例
 実施例16: ヒト毛根サンプルからの簡便なPCR増幅例
 実施例17~20 
 実施例21~22 
 実施例23~24 
 実施例25: コロニーPCRによる酵母形質転換体の確認
 実施例26: 新規イネOsSRS3遺伝子の5´領域の単離
 実施例27: ヒト糞便から精製したDNAを用いたHelicobacter pylori cagA遺伝子の増幅
 実施例28: トランスジェニックラット血液(ろ紙血)からのGFP遺伝子の検出
 実施例29: DGGE法を用いた沿岸海域に生息する植物プランクトン(クリプト藻)の多様性の解析
 実施例30: KOD FXを用いた緑膿菌DNAの遺伝子増幅
 実施例31: マウス尾溶解液からのゲノムDNAの増幅
 実施例32: 病原酵母Cryptococcus neoformans菌体(コロニー)からのダイレクトPCR
 実施例33: カビ(Aspergillus oryzae)からのダイレクトPCR
 実施例34: ホルマリン固定パラフィン包埋切片から抽出したDNAの解析
 実施例35: KOD FX を用いたキイロショウジョウバエの羽からの簡便なロングPCR法
 実施例36: KOD FX を用いたマウス濾紙血によるPCR解析
 実施例37: KOD FX を用いた淡水産シオグサ属藻類(緑藻)のDNA断片増幅
 実施例38: KOD FX を用いた麹菌Aspergillus oryzaeの遺伝子破壊の確認
 実施例39: KOD FXを用いたコロニーPCRによる各種細菌DNAの検出
 実施例40: 高成功率PCR酵素 KOD FXを用いた爪からの直接PCR
 実施例41: 高成功率PCR酵素 KOD FXを用いたタバコ葉からの直接PCR
 実施例42: KOD FX を用いた植物葉からの迅速DNA増幅
 実施例43: メダカ幼魚の遺伝子による性別判断方法
 

参考文献

1) K. Wakahara et al., Mol Cancer Res 6: 1937-1945.(2008)
2) N. Yamada et al., Mol Vis., 15::974-979.(2009)
 

製品内容

KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)  200μl×1本
2×PCR Buffer*[KFX-1B]  1.7ml×3本
2mM dNTPs[NTP-201]**  1ml×2本
* 終濃度2.0mMのMg2+を含有します。
** 本酵素によるPCRは、dNTPs[NTP-201]をお使いください。他のdNTPsでは、充分な性能を得られない場合があります。

※50μlで反応を行なった場合、200回用としてご使用いただけます。
 

形状:
50mM Tris-HCl(pH8.0)
0.1mM EDTA
1mM DTT
0.001% Tween® 20
0.001% Nonidet® P-40
50% Glycerol

活性の定義:
7 5 ℃ 活性測定条件で3 0 分間に10nmolesの全ヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量を1Uとします

起源:
E.coli 組換体
 

基本反応条件

反応液組成
滅菌蒸留水Xμl
2x PCR Buffer for KOD FX  25μl
2mM dNTPs  10μl(0.4mM)
各Primer  15pmoles each
鋳型  1~50ng(Plasmid)
  10~200ng(Genome DNA)
  ~200ng[RNA相当](cDNA)
  ~2μl(クルードサンプル)
  〈ワンステップ法の植物ライセートは1μl〉
KOD FX (1U/μl)  1μl(1U)
Total Volume  50μl

〈2ステップサイクル〉*
94℃ 2min.

98℃ 10sec. 
68℃ 1min./kb 25~40 cycles

〈3ステップサイクル〉*
94℃ 2min.

98℃ 10sec. 
(Tm-5)℃ 30sec.
68℃ 1min./kb 25~40 cycles  

〈ステップダウンサイクル〉*
94℃, 2min.

98℃, 10sec.
74℃, 1min./kb 5 cycles

98℃, 10sec.
72℃, 1min./kb 5 cycles

98℃, 10sec.
70℃, 1min./kb 5 cycles

98℃, 10sec. 
68℃, 1min./kb 15~25 cycles

68℃, 7min.

*2ステップサイクルを基本としています。プライマーのTm値が68℃未満または2ステップサイクルで増幅が見られない場合は、3ステップサイクルをお試しください。また、10kb以上のターゲットを増幅するLong PCRやエキストラバンドあるいはスメアが見られた場合には、ステップダウンサイクルをお試しください。

プライマーのTm値の計算は、最近接塩基対法(Nearest Neighbor method)を用いております。プライマーのTm値計算表(EXCEL)は、こちらからダウンロードいただけます。

<アルカリ溶解法>
1) マウステール(約3mm)をマイクロチューブへ入れる。
2) 50mM NaOHを180μl添加。
3) Vortexにてよく攪拌。
4) 95℃・10min.
5) Tris-HC(l pH8.0)を20μl添加。
6) Vortexにてよく攪拌。
7) 遠心(12,000rpm, 10min.)
8) 上清0.5~2μlをPCR反応液に添加。
(マウステールは完全には溶解しません)

<ワンステップ法>
1) 葉(3mm角)または精米(1粒)をマイクロチューブへ入れる。
2) Buffer A*を100μl添加。
3) Vortexにてよく攪拌。
4) 95℃・10min.
5) Vortexにてよく攪拌。
6) 遠心(12,000rpm, 10min.)
7) 上清1μlをPCR反応液に添加。
(植物組織は完全には溶解しません)

*Buffer A:
 100mM Tris-HC(l pH9.5)
 1M KCl
 10mM EDTA

ワンポイントアドバイス

(FAQはこちら

●PCR産物のクローニング
本酵素のPCR産物は平滑化されているため、平滑末端クローニング法によってクローニングできます。
その際、ベクター側を脱リン酸化処理している場合、リン酸化を行ったPCR産物を用いるか、リン酸化プライマーを用いて増幅したPCR産物を用いる必要があります。
また、本酵素のPCR産物は平滑化されているため、そのままではTAクローニングすることはできません。
専用の高効率TAクローニングキット「TArget CloneTM -Plus-」を用いると簡便・高効率にTAクローニングが可能です。

●プライマーについて
10kbを超えるターゲットを増幅する場合には、カートリッジ精製以上のグレードで、27mer以上のプライマーの使用をお薦めします。
また、3'側にミスマッチのあるプライマーは、本酵素によって校正を受ける場合があります。

 

関連商品

(別売りパーツ)

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
2× PCR Buffer for KOD FX KFX-1B 1.7ml×3本 ¥5,000 -20℃ SDS 該当無し
dNTPs Mixture(2mM) NTP-201 1.0ml ¥8,000 -20℃ データシート 該当無し

●KODシリーズ用高効率TAクローニングキット

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
TArget Clone -Plus- TAK-201 10回用 ¥16,000 -20℃ 取扱説明書 該当無し
※1 法規制について
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
: 消防法に基づく危険物です。
: 御購入時に申込書の提出が必要な製品です。
: 「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」 (カルタヘナ法)に基づく組換え体または昆虫細胞組換え体で生産されたタンパク質です。
該当なし: 上記法令や申込書の提出に該当しない製品です。