逆転写活性を有するユニークなPCR用ポリメラーゼです。

rTth DNA Polymerase

価格表

Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
TTH-301 250U×1本 ¥15,000 -20℃ データシート SDS 該当無し

用途

●PCR、RT-PCR

説明

高度好熱菌Thermus thermophilus HB8由来の耐熱性DNA Polymeraseであり、組換え体で生産したリコンビナントタイプです。
本酵素は逆転写活性を持ち、その活性はMn2+存在下にて強く促進されます。この性質を利用して、逆転写反応とPCRを同一の酵素で行うこと(1-step RT-PCR)ができます。
また、Taq DNA polymeraseよりも耐熱性が高く、GC-richなターゲットの増幅効率にも優れるという特長があります。
 

特長

●高効率
Taq DNA polymeraseに比べ、GC-rich ターゲットやクルードサンプルなどの増幅効率に優れています。

●1液系でRT-PCR可能
本酵素は、Mn2+存在下でRTase活性を示すため、RT-PCRに使用できます。
また、60℃においてRT反応が可能なため、GC-richなターゲットや高次構造をとりやすいターゲットの増幅にも適しています。
 

実施例

1.Tth DNA Polymeraseを用いたゲノムPCR

本酵素を用いて、ヒトゲノム50ngを鋳型として、ターゲット長180bp〜1.3kbのPCRを行いました。
その結果、それぞれの鋳型について良好な増幅が見られました。
本酵素では様々なターゲットについてPCRを行うことができます。


 

2. rTth DNA Polymeraseを用いたRT-PCR例

本酵素を用いて、酵母Total RNA1μgを鋳型とした、アクチン(ターゲット長180bpと300bp)のRT-PCR、および二次構造を取りやすいと思われた18S rRNA(380bp)のRT-PCRをヒトTotal RNA(100pg、10pg)を鋳型として行いました。
また18S rRNAは、M-MLV Rtase + Taq DNA PolymeraseのRT-PCRとの比較を実施しました。

RT反応条件
0.2mM dNTPs、1mM MnCl2、Reverse Primer 2pmoles/μl、10U Rnase Inhibitor、および 5U rTth DNA Polymeraseを含むRT Buffer(10mM Tris-HCl(pH8.3)、90mM KCl)20μl中で、60℃、30min.行いました。

PCR条件
10×Chelating Buffer(100mM Tris-HCl(pH8.3)、1M KCl、7.5mM EGTA、0.5% Tween20)を1×濃度になるようにRT反応液に添加した後、Forward Primerを0.4pmoles/μl、MgCl2を1.88mMになるように添加し、Final 100μlの系でサイクルを行いました。



その結果、良好なRT-PCRの結果を得ることができました。また二次構造を取りやすいと思われた、rRNAを鋳型としたRT-PCRにおいては、60℃でRT反応を行ったrTth DNA Polymeraseの方が、
M-MLV Rtase 42℃で行ったものより強い増幅が確認できました。
今回はrTth DNA Polymeraseを用いましたがTth DNA Polymeraseでも問題はありません。
またワンステップ反応でRT反応とPCRを反応を行う場合には、本酵素を使用したキット「RT-PCR Quick Master Mix」をお薦めします。



 

参考文献

1) T. W. Myers and D. H. Gelfand, Biochem., 30: 7661-7666(1991)
2) K. Yamada et al., J. Biochem.(Tokyo), 130: 335-340(2001)
 

製品内容

Tth DNA Polymerase(5U/μl)  50μl
10×Buffer[TTH-3R]  1ml
Dilution Buffer[TTH-3D]  1ml
2mM dNTPs[NTP-201]* 1ml

* 本酵素によるPCRは、dNTPs[NTP-201]をお使いください。他のdNTPsでは、充分な性能を得られない場合があります。
 

形状:
10mM Tris-HCl(pH7.5)
300mM KCl
0.1mM EDTA
1mM DTT
1% Triton® X-100
500μg/ml BSA
50% Glycerol

10×Buffer組成:
100mM Tris-HCl(pH8.9)
800mM KCl
15mM MgCl2
1% Triton® X-100
1% コール酸ナトリウム
5mg/ml BSA

Dilution Buffer組成:
形状と同じ組成です。

活性の定義:
75℃において、30分に10nmolesの全ヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量を1Uとします。

起源:
E.coli 組換体
 

注意事項


*酵素溶液には、消防法危険物 第4類
 引火性液体 第3石油類 水溶性液体に
 該当するグリセロールが 50%含まれ
 ますが、引火点測定試験で危険物に
 該当しないことを確認しております。
 

ワンポイントアドバイス

●PCR産物のクローニング
本酵素によるPCR産物は、Taq DNA polymeraseと同様にTAクローニング法によってクローニングできます。本酵素は校正活性を示さないため、PCR時の正確性はMg2+存在下においてはTaq DNA polymeraseとほぼ同等です。
高効率TAクローニングキット「TArget CloneTM」などをご使用いただけます。

●PCR条件の設定について
基本的にはTaq DNA polymeraseと同じ条件にて行うことができます。増幅がみられない時には、変性からアニーリングの移行過程に、1sec./1℃のスロープを設定すると良い場合があります。

●RT-PCR反応
本酵素はMn2+存在下において、逆転写反応とPCRを同一酵素で行うことができますが、正確性が落ちるため、RT-PCR産物のシーケンスやクローニング目的には向きません。
 

関連商品

(別売りパーツ)

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
rTth DNA Polymerase用 Buffer TTH-3R 1ml ¥1,000 -20℃ SDS 該当無し
rTth DNA Polymerase用 Dilution Buffer TTH-3D 1ml ¥1,000 -20℃ SDS 該当無し
dNTPs Mixture(2mM) NTP-201 1.0ml ¥8,000 -20℃ データシート 該当無し

●高効率TAクローニングキット

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
TArget Clone TAK-101 10回用 ¥12,000 -20℃ 取扱説明書 該当無し

●Tthポリメラーゼを用いたワンステップRT-PCRキット

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
RT-PCR Quick Master Mix PCR-311 50回用 ¥45,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
※1 法規制について
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
: 消防法に基づく危険物です。
: 御購入時に申込書の提出が必要な製品です。
: 「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」 (カルタヘナ法)に基づく組換え体または昆虫細胞組換え体で生産されたタンパク質です。
該当なし: 上記法令や申込書の提出に該当しない製品です。