1-stepタイプのRT-PCRキットです。従来品に比べ、検出感度が約100倍向上しました。

One Step RT-PCRキット RT-PCR Quick Master Mix

価格表

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
RT-PCR Quick Master Mix PCR-311 50回用 販売中止 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し
RT-PCR Quick Master Mix
*コントロールなし*
PCR-311F 50回用 ¥44,000 -20℃ 取扱説明書 SDS 該当無し

用途

●RT-PCR

説明

本品は、rTth DNA Polymerase を使用した、1酵素・1-step系のRT-PCRキットです。ホットスタートにも対応し、より高感度な検出が可能となりました。
Tth DNA polymeraseはMn2+存在下で、逆転写活性を示すユニークな酵素であり、本酵素を用いることで同一チューブ内でcDNA合成反応とPCRを連続的に行うことができ、さまざまな用途にご使用になれます。
 

実施例

1. 当社従来品との感度比較

ヒトG3PDH mRNA*とプライマーセットを使用し、約450bpの領域を標的としたRT-PCRを行いました。
RT-PCR Quick Master Mixは、当社従来品と比べて2桁以上の高感度を示しました。

B: ブランク反応

【サンプル】ヒトG3PDH mRNA* (106 ~ 102コピー/50μl反応系)
*in vivo transcriptionにて調製しました。

【プライマー】
Primer(F): 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (20mer)
Primer(R): 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (20mer)

【サイクル条件】
90℃ 0:30 →60℃ 30:00 →94℃ 1:00
→ (94℃ 0:30 → 60℃ 0:30 → 72℃ 1:00) x 40サイクル
→72℃ 1:00
 

2. mRNAを用いたcdc2遺伝子の検出

ヒト培養細胞由来mRNA(5ng、0.5ng)を鋳型とし、ヒトcdc2のORF全長(約900bp)をターゲットとしたRT-PCRを行いました。
cdc2はセルサイクルに関わるタンパク質をコードしています。
その結果、当社従来品では検出できなかったターゲットが、RT-PCR Quick Master Mixによる反応では良好な増幅を示すことが分かりました。

【プライマー】
Cdc2-F : 5'-CCATACCATTGACTAACTATGGAAGAT-3' (27mer)
Cdc2-R : 5'-GTCAGAAAGCTACATCTTCTTAATCTG -3' (27mer)
            
【サイクル条件】
90℃ 0:30 →60℃ 30:00 →94℃ 1:00
→(94℃ 0:30 → 60℃ 0:30 → 72℃ 1:00) x 40サイクル
→72℃ 1:00
 

参考文献

1)T. W. Myers and D. H. Gelfand, Biochem., 30: 7661-7666(1991)
 

製品内容
【PCR-311】  
2XRT-PCR Quick Master Mix
   625μL×2本
50mM Mn(OAc)2 200μL×1本
Nuclease-free Water 1100μL×1本
Positive Control RNA    50μL×1本
Control Primer F  
50μL(10pmoles/μL)×1本
Control Primer R  
50μL(10pmoles/μL)×1本
   
【PCR-311F】  
2XRT-PCR Quick Master Mix
  625μL×2本
50mM Mn(OAc)2 200μL×1本
Nuclease-free Water 1100μL×1本
注意事項

(パーツ変更のお知らせ)

基本反応条件

滅菌蒸留水 XμL
2×Master Mix  25μL
50mM Mn(0Ac)2  2.5μL
各Primer 10pmoles each
RNAサンプル
  Total RNA  <2.5μg
  Poly(A)+ RNA < 500 ng
Total Volume 50μL

Cycle
90℃, 30sec.
60℃, 30min.

94℃, 1min.

94℃, 30sec.
50~70℃ 30sec. 30~40Cycles
72℃, 1min.

72℃, 7min.

※アニーリング温度は、プライマーのTm値などを考えて、50~70℃の間で調整します。

ワンポイントアドバイス

●ゲノムDNAのコンタミネーションについて
あらかじめ、DNase処理を行いゲノムを除去するか、下記のA, Bの方法でプライマー設計をすることで、ゲノムの影響を回避できます。

A. イントロンを挟むようなプライマー→PCR産物の長さで区別する。
B. 2つのイントロンにまたがるようなプライマー→PCR産物ができないようにする。

●逆転写反応時のプライマーについて
PCR用のReverse Primerがそのまま逆転写用のプライマーとなります。
別途添加する必要はありません。また、Oligo dTやRandom Primerは使用できません。

●RT-PCR産物のクローニング
本キットではMn2+の存在下でPCRを行うため、Mg2+を用いる通常のPCRに比べさらに正確性が低下する傾向にあります。よって本製品は、クローニング用でのPCRには適しません。

プライマーのTm値の計算は、最近接塩基対法(Nearest Neighbor method)を用いております。プライマーのTm値計算表(EXCEL)は、こちらからダウンロードいただけます。イノシンを含むプライマーのTm値はこの方法では計算できません。

   トラブルシューティングは
こちら

関連商品

●PCR用酵素

品名 Code No. 包装 価格 保存温度 取扱説明書
データシート
SDS 法規制※1
rTth DNA Polymerase TTH-301 250U×1本 ¥15,000 -20℃ データシート SDS 該当無し
※1 法規制について
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
: 毒物及び劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
: 消防法に基づく危険物です。
: 御購入時に申込書の提出が必要な製品です。
: 「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」 (カルタヘナ法)に基づく組換え体または昆虫細胞組換え体で生産されたタンパク質です。
該当なし: 上記法令や申込書の提出に該当しない製品です。